Discovery and Characterization of Terpenoid Biosynthetic Pathways of Fungi
- 作者
- Grayson T. Wawrzyn, Sarah E. Bloch, Claudia Schmidt-Dannert
- 单位
- Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota, St. Paul, Minnesota, USA
- DOI
- 10.1016/B978-0-12-394290-6.00005-7
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
真菌萜类化合物（尤其是倍半萜）生物合成途径的发现与表征方法缺乏系统梳理，大量新基因组中的萜类合酶和基因簇未被挖掘。
研究策略
系统综述真菌萜类合酶基因的鉴定与克隆（无序列信息/有序列信息）、异源表达与产物分析、晶体结构与分子模型指导的理性工程、生物合成基因簇的定位与重构、系统发育指导的基因组挖掘等方法，并给出具体实验流程。
研究路线图
核心内容
该论文系统综述了真菌萜类生物合成途径的发现与表征方法，涵盖基因鉴定与克隆、异源表达与产物分析、晶体结构指导的理性工程、生物合成基因簇定位与重构，以及系统发育指导的基因组挖掘等技术路线。研究整合了从基因组序列、基因簇、酶结构到代谢工程的完整框架，强调利用公共基因组数据和合成生物学工具快速发现新萜类天然产物。关键结果包括在灰盖鬼伞中鉴定出6个倍半萜合酶，其中Cop4活性位点较大可产生多种产物，Cop6活性位点受限专一产生α-cuprenene且突变不改变选择性；在产illudin的Omphalotus olearius中通过基因组挖掘发现11个推测倍半萜合酶；Phoma betae的aphidicolin基因簇约15.6 kb，Phomopsis amygdali的fusicoccin基因簇约20 kb。将cop6与两个细胞色素P450基因在酿酒酵母WAT11中共表达可部分重构α-cuprenene氧化修饰途径。研究指出测序成本下降使数据不再是瓶颈，未来需加强已有基因组数据的功能生化表征，以发现更多具有药用价值的新天然产物，为代谢工程提供新策略。
创新点
整合多种技术路线，提出从基因组序列、基因簇、酶结构到代谢工程的完整研究框架；强调利用公共基因组数据和合成生物学工具快速发现新萜类天然产物。
研究对象（19）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Penicillium roqueforti | 倍半萜生物合成 | ari1 | aristolochene synthase | 催化 | 首批克隆的真菌倍半萜合酶，催化FPP环化生成aristolochene |
| Aspergillus terreus | 倍半萜生物合成 | — | aristolochene synthase | 催化 | 已解析晶体结构，作为Cop4分子模型模板 |
| Fusarium sporotrichioides | 单端孢霉烯（trichothecene）生物合成 | Tri5 | trichodiene synthase | 催化 | 催化FPP环化生成trichodiene，trichothecene途径第一步 |
| Phaeosphaeria sp. L487 | 赤霉素（gibberellin）生物合成 | — | ent-kaurene synthase | 催化 | 双功能二萜环化酶，催化GGPP环化生成ent-kaurene |
| Phoma betae | aphidicolin生物合成 | — | aphidicolan-16β-ol synthase | 催化 | 催化形成aphidicolin二萜骨架的关键酶 |
| Armillaria gallica | protoilludene倍半萜合成 | — | protoilludene synthase | 催化 | 通过cDNA文库测序鉴定，催化抗微生物melleolides生物合成第一步 |
| Botrytis cinerea | botrydial生物合成 | — | presilphiperfolan-8β-ol synthase | 催化 | 基因组挖掘发现的倍半萜合酶，位于botrydial生物合成基因簇 |
| Coprinus cinereus | 倍半萜生物合成 | cop4 | Cop4倍半萜合酶 | 催化 | 多产物合酶，活性位点较大，可产生多种倍半萜产物 |
| Coprinus cinereus | 倍半萜生物合成 | cop5 | Cop5倍半萜合酶 | 催化 | 所有基因预测尝试均未获得功能表达，克隆受内含子预测影响 |
| Coprinus cinereus | α-cuprenene生物合成 | cop6 | α-cuprenene合酶 | 催化 | 产物单一，活性位点较小，突变不改变产物特异性 |
| Omphalotus olearius | illudin倍半萜生物合成 | — | 11个推定倍半萜合酶 | 催化 | 抗癌真菌亮菌的基因组中发现，多数未表征 |
| Coprinus cinereus | 倍半萜后修饰 | — | 两个细胞色素P450酶 | 催化 | 与cop6共定位在基因簇中，共表达实现α-cuprenene氧化修饰 |
| Fusarium sporotrichioides | trichothecene生物合成 | Tri12 | Tri12转运蛋白 | 转运 | tri5簇中的转运蛋白，可能负责毒素外排 |
| Fusarium sporotrichioides | trichothecene生物合成 | Tri6, Tri10 | Tri6/Tri10转录因子 | 调控 | 调控tri5簇基因表达，FgTri6过表达可提高trichothecene产量 |
| Botrytis cinerea | botrydial生物合成 | bga1 | Bga1负调控因子 | 调控 | 敲除bga1可导致高botrydial产量 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 异源萜类合成 | — | NADPH-CYP还原酶 | 能量供给 | 为真菌CYP提供还原力，用于异源途径重构 |
| Phoma betae | aphidicolin生物合成 | PbGGS | GGPP合酶 | 催化 | aphidicolin基因簇中的GGPP合酶，提供前体 |
| Fusarium fujikuroi | 赤霉素生物合成 | ggs2 | GGPP合酶 | 催化 | 赤霉素基因簇中的GGPP合酶，参与提供GGPP前体 |
| Escherichia coli | 异源萜类合成 | 异源萜类合酶基因 | 重组萜类合酶 | 催化 | 常用异源表达宿主，用于真菌萜类合酶功能表征 |
关键发现
- ['在 Coprinus cinereus 中鉴定出 6 个倍半萜合酶（Cop4/Cop5/Cop6等），Cop4 活性位点较大，产生多种倍半萜产物
- Cop6 活性位点受限，专一产生 α-cuprenene，且突变不改变产物选择性。', '在抗癌产 illudin 的 Omphalotus olearius 中通过基因组挖掘发现 11 个推测倍半萜合酶。', 'JGI 真菌基因组计划中已有 111 个 Ascomycota 和 54 个 Basidiomycota 基因组序列可用于萜类合酶挖掘。', 'Phoma betae 的 aphidicolin 生物合成基因簇约 15.6 kb
- Phomopsis amygdali 的 fusicoccin 基因簇约 20 kb。', 'Fusarium sporotrichioides 的 trichothecene 生物合成基因分为两簇：tri5 簇含 12 个基因（包括合酶和转录因子），另一簇含 2 个晚期途径基因，另有 1 个独立基因。', '将 Coprinus cinereus 的 cop6 基因与两个细胞色素 P450 基因在 S. cerevisiae WAT11 中共表达，可部分重构 α-cuprenene 氧化修饰途径，表明 WAT11 菌株（表达 NADPH-CYP还原酶）适合真菌 CYP 异源表达。']
研究结论
真菌萜类生物合成途径研究已从传统的蛋白纯化进入基因组挖掘和异源途径重构阶段。测序成本下降使数据不再是瓶颈，未来需要加强测序数据的功能生化表征，以发现更多具有药用价值的新天然产物，并为代谢工程提供新策略。