Production of human gastric lipase in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe
- 作者
- Gary R. Smerdon, Stephen J. Aves, E. Fintan Walton
- 单位
- Department of Biological Sciences, University of Exeter; Cellectech Ltd.
- 杂志
- Gene（1995）
- DOI
- 10.1016/0378-1119(95)00495-r
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe 中异源表达人胃脂肪酶（hGL），评估其作为生产宿主的能力，为胰腺脂肪酶缺乏症提供酶替代疗法。
研究策略
构建分别由裂殖酵母同源 adh1 启动子和异源 CaMV 35S 启动子驱动 hGL cDNA 表达的多拷贝质粒，转化裂殖酵母后通过平板透明圈和电位滴定检测分泌的脂肪酶活性；利用 Western blot 分析糖基化状态；并测定表达 hGL 对宿主生长速率和质粒拷贝数的影响。
核心内容
该研究在裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中实现了人胃脂肪酶（hGL）的异源表达与分泌，首次证明该宿主可正确糖基化并产生具有生物学活性的重组hGL。研究分别构建了由同源adh1启动子和异源CaMV 35S启动子驱动的多拷贝表达质粒，通过平板透明圈和电位滴定检测分泌脂肪酶活性，并利用Western blot分析糖基化状态。结果显示，adh1启动子驱动的细胞壁相关脂肪酶活性最高，活性在对数早期达峰值，进入稳定期后约下降一半。Western blot表明分泌产物中较小分子量组分与天然hGL（50 kDa）大小一致，经内切糖苷酶H处理后均归为约40 kDa，且产物糖基化异质性低于酿酒酵母。然而，hGL表达对宿主造成显著负担：pGSL10转化株平均倍增时间为5小时48分钟，较对照增加约62%；质粒平均拷贝数仅为2–3拷贝/细胞，较对照的11–12拷贝降低超75%。该研究表明裂殖酵母适合作为hGL生产的宿主，但需通过诱导型启动子或表达系统优化来缓解生长抑制和质粒不稳定问题。
创新点
首次在裂殖酵母中成功表达并分泌具有活性的人胃脂肪酶；证明该宿主产生的重组 hGL 与天然蛋白分子量一致，且糖基化异质性低于酿酒酵母；系统比较了同源与异源启动子的表达效果；揭示了重组蛋白表达对宿主生长和质粒稳定性的影响。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Schizosaccharomyces pombe（裂殖酵母） | 甘油三酯脂解 | hGL | 人胃脂肪酶（hGL） | 催化 | 分泌型脂肪酶，催化甘油三酯水解，在 Padh1 或 CaMV 35S 启动子驱动下表达并分泌。 |
| Schizosaccharomyces pombe（裂殖酵母） | — | adh1（启动子） | — | 调控 | 同源强组成型启动子（Padh1），驱动 hGL cDNA 表达，表达水平高于 CaMV 35S 启动子。 |
| Schizosaccharomyces pombe（裂殖酵母） | — | CaMV 35S 启动子 | — | 调控 | 异源组成型启动子，驱动 hGL cDNA 表达，活性弱于 Sp adh1 启动子。 |
| Schizosaccharomyces pombe（裂殖酵母） | 分泌途径（内质网-高尔基体糖基化） | met hGL（缺失信号肽的 hGL 突变体） | hGL 蛋白（胞内形式） | 催化 | 编码缺乏天然分泌信号肽的 hGL，用于胞内积累，产物大小与脱糖基化天然 hGL 相近。 |
关键发现
- 在裂殖酵母中，hGL cDNA 受 Padh1 或 CaMV 35S 启动子驱动时均有活性脂肪酶分泌，以 Padh1 驱动的细胞壁相关脂肪酶活性最高
- 活性在对数早期达到峰值，进入稳定期后约下降一半，稳定期 12 小时后几乎消失。Western blot 显示分泌产物中较小分子量组分与天然 hGL（50 kDa）大小一致，主要分泌产物分子量更高
- 胞内存在多个分子量种，其中 40 kDa 为主要脱糖基化形式
- 经内切糖苷酶 H 处理后全部归为约 40 kDa。缺失信号肽的 met hGL 在胞内积累，大小与脱糖基化 hGL 接近。hGL 表达显著减缓生长，pGSL10 转化株平均倍增时间为 5 h 48 min，而对照 pART1 为 3 h 35 min（增加约 62%）
- pGSL10 质粒平均拷贝数仅为 2–3 拷贝/细胞，对照为 11–12 拷贝/细胞，降低约 75%以上。
研究结论
裂殖酵母能够正确糖基化并分泌具有生物学活性的人胃脂肪酶，且产物均一性优于酿酒酵母，但高表达 hGL 对细胞生长和质粒维持造成严重负担，需要进一步优化表达系统或采用诱导型启动子来缓解。