Strategies for Engineering Plant Natural Products: The Iridoid-Derived Monoterpene Indole Alkaloids of Catharanthus roseus
- 作者
- Sarah E. O'Connor
- 单位
- John Innes Centre, Department of Biological Chemistry, Norwich Research Park, Norwich, United Kingdom; School of Chemistry, The University of East Anglia, Norwich Research Park, Norwich, United Kingdom
- 杂志
- Methods in Enzymology（2012）
- DOI
- 10.1016/B978-0-12-394290-6.00009-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过代谢工程策略在长春花（Catharanthus roseus）中高效生产非天然的单萜吲哚生物碱类似物，克服植物途径基因未完全解析、酶底物特异性狭窄等障碍。
研究策略
采用前体定向生物合成（向植物组织饲喂色胺或secologanin类似物）、突变合成（RNAi沉默TDC基因阻断天然底物合成，再饲喂非天然前体）以及工程化途径酶（基于晶体结构设计strictosidine synthase的Val214Met突变体以拓宽底物谱）三种互补策略，结合毛状根组织和幼苗培养体系实现非天然生物碱的产生。
核心内容
该研究以长春花毛状根和幼苗为体系，系统探索了三种代谢工程策略以实现单萜吲哚生物碱非天然类似物的定向生产。研究者首先采用前体定向生物合成，向培养体系饲喂色胺或断马钱子苷类似物，成功在吲哚环4、5、6、7位引入氟、羟基或甲基取代，部分衍生物经制备HPLC纯化达毫克级产量。其次，通过RNAi沉默色氨酸脱羧酶基因阻断天然底物合成，再饲喂非天然前体进行突变合成，发现沉默系在1000微摩尔以上外源色胺条件下不出现野生型所见的生长抑制，且5-氟色胺饲喂产生的氟化阿马利辛和氟化长春质碱产量高于野生型前体定向培养。第三种策略基于strictosidine synthase晶体结构设计Val214Met突变体，使5-氯、5-甲基和5-溴色胺进入生物碱通路，LC-MS确认仅突变酶能催化生成新化合物。此外还开发了炔烃-叠氮点击化学方法从粗提物中纯化非天然代谢物。该研究证明，在通路基因尚未完全解析时，组合前体饲喂、基因沉默与酶工程可在植物培养体系中实现非天然生物碱的定向合成，为植物药物先导化合物的生物制造提供了可行路径。
创新点
['首次系统证明长春花毛状根培养可通过前体定向生物合成产生多种非天然生物碱类似物', '利用RNAi沉默TDC实现突变合成，显著简化非天然产物图谱并提高某些氟化生物碱的产量', '基于strictosidine synthase晶体结构设计Val214Met突变体，使5-位取代色胺类似物能够进入生物碱通路', '开发了通过点击化学（alkyne-azide环加成）从粗提物中分离非天然代谢物的方法']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus hairy root culture | Monoterpene indole alkaloid biosynthesis | TDC | Tryptophan decarboxylase | 催化 | 催化色氨酸脱羧生成色胺；RNAi沉默用于突变合成 |
| Catharanthus roseus hairy root culture | Monoterpene indole alkaloid biosynthesis | STR | Strictosidine synthase | 催化 | 催化色胺和secologanin缩合生成strictosidine；Val214Met突变体拓宽底物谱 |
| Catharanthus roseus hairy root culture | Monoterpene indole alkaloid biosynthesis | SGD | Strictosidine glucosidase | 催化 | 水解strictosidine的糖苷键，生成活性半缩醛中间体 |
| Catharanthus roseus seedling | Secologanin biosynthesis | G10H | Geraniol 10-hydroxylase | 催化 | 催化香叶醇10位羟基化，进入环烯醚萜合成途径 |
| Catharanthus roseus seedling | Secologanin biosynthesis | LAMT | Loganic acid methyltransferase | 催化 | 催化loganic acid甲基化 |
| Catharanthus roseus seedling | Secologanin biosynthesis | SLS | Secologanin synthase | 催化 | 催化loganic acid氧化为secologanin |
关键发现
- 在1 mM色胺类似物条件下，长春花毛状根培养可产生分别位于吲哚环4、5、6、7位带氟、羟基或甲基取代的生物碱衍生物，部分类似物经制备HPLC纯化获得毫克级产物
- secologanin pentynyl衍生物可被掺入生物碱并通过点击化学用生物素标记纯化。TDC RNAi沉默的毛状根系中，所有主要色胺来源生物碱产量显著下降
- 添加62.5–2500 μM外源色胺可剂量依赖性地恢复生物碱合成，且沉默系在≥1000 μM外源色胺下不出现野生型所见的生长抑制和褐变
- 饲喂250–2500 μM 5-氟色胺时，沉默系产生氟化阿马利辛、氟化长春质碱、氟化它波宁等，其中氟化阿马利辛和氟化长春质碱的产量高于野生型前体定向培养。表达strictosidine synthase Val214Met突变体的毛状根在添加5-氯、5-甲基或5-溴色胺后，LC-MS检测到仅由突变酶催化产生的新化合物，而野生型STR对照无此产物。
研究结论
该研究证明，即使植物生物合成通路尚未完全解析，通过组合前体饲喂、基因沉默和酶工程策略，可在长春花培养体系中实现单萜吲哚生物碱非天然类似物的定向生产，为植物来源药物先导化合物的生物合成提供了可行路径。随着更多植物通路基因的解析和异源表达体系的成熟，植物代谢工程将发挥更大作用。