Combined overexpression of genes of the ergosterol biosynthetic pathway leads to accumulation of sterols in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Markus Veen, Ulf Stahl, Christine Lang
- 单位
- Technische Universität Berlin, Institut für Biotechnologie, FG Mikrobiologie und Genetik, Gustav-Meyer-Allee 25, D-13355 Berlin, Germany
- 杂志
- FEMS Yeast Research（2003）
- DOI
- 10.1016/S1567-1356(03)00126-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何系统解除酿酒酵母麦角固醇生物合成途径后鲨烯部分的瓶颈，将积累的鲨烯转化为终产物麦角固醇，实现固醇的高产
研究策略
在截短HMG-CoA还原酶（tHMG1）导致鲨烯积累的菌株中，系统过表达后鲨烯途径的各个基因及其组合，通过GC分析固醇组成变化，结合转录分析、洛伐他汀抑制实验鉴定限速步骤
核心内容
本研究在酿酒酵母中系统考察了麦角固醇生物合成途径后鲨烯部分的代谢瓶颈。作者以截短HMG-CoA还原酶（tHMG1）导致鲨烯积累的菌株为背景，逐一及组合过表达ERG1、ERG7、ERG11、ERG24等后鲨烯途径基因，通过GC分析固醇组成变化，并结合洛伐他汀抑制实验和转录分析鉴定限速步骤。结果显示，单独过表达ERG1使鲨烯含量降低52%、羊毛固醇提高3.6倍、总固醇提高1.5倍；过表达ERG11使总固醇提高1.2倍。组合过表达ERG1与ERG11可协同解除两个限速步骤，使鲨烯从10.6降至3.2（约3倍），总固醇含量比单独tHMG1菌株高1.9倍，达到野生型的3倍。多数积累的固醇以甾醇酯形式储存，游离甾醇几乎不变。研究证实酿酒酵母中至少三个步骤控制多余固醇合成：HMG-CoA还原酶、鲨烯环氧化酶Erg1p和羊毛固醇14α-脱甲基酶Erg11p，组合过表达这三个限速酶是提高固醇产量的有效策略。
创新点
首次系统组合过表达ERG1和ERG11，协同解除两个限速步骤，使总固醇含量比野生型提高3倍，同时鲨烯含量降低约3倍
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径 | HMG1 | Hmg1p（截短形式） | 催化 | HMG-CoA还原酶，截短形式（tHMG1）过表达使早期途径去调控，导致鲨烯积累 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG1 | Erg1p | 催化 | 鲨烯环氧化酶，催化鲨烯转化为2,3-环氧鲨烯；过表达显著降低鲨烯、增加羊毛固醇 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG7 | Erg7p | 催化 | 羊毛固醇合酶，催化2,3-环氧鲨烯环化为羊毛固醇；过表达对固醇含量无显著影响 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG11 | Erg11p | 催化 | 羊毛固醇14α-脱甲基酶；过表达降低羊毛固醇、增加下游固醇，与ERG1组合有协同效应 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG24 | Erg24p | 催化 | C-14固醇还原酶；过表达影响羊毛固醇等早期甾醇 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG25 | Erg25p | 催化 | C-4甲基固醇氧化酶；过表达对总固醇影响不大 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG26 | Erg26p | 催化 | C-3固醇脱氢酶；过表达对总固醇影响不大 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG27 | Erg27p | 催化 | 3-酮还原酶；过表达增加羊毛固醇和4,4-二甲基酵母固醇 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG6 | Erg6p | 催化 | C-24甲基转移酶；过表达降低酵母固醇，但未检测到相应产物增加 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG2 | Erg2p | 催化 | C-8固醇异构酶；过表达对总固醇影响不大 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG3 | Erg3p | 催化 | C-5脱饱和酶；过表达增加早期甾醇，降低表酵母固醇 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG5 | Erg5p | 催化 | C-22脱饱和酶；过表达降低表酵母固醇，积累未鉴定中间体 |
| Saccharomyces cerevisiae AH22tH3ura8 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯部分） | ERG4 | Erg4p | 催化 | C-24(28)还原酶；过表达增加早期甾醇，降低表酵母固醇 |
关键发现
- 过表达ERG1使鲨烯含量降低52%，羊毛固醇含量提高3.6倍，总固醇含量提高1.5倍
- 过表达ERG11使总固醇含量提高1.2倍，后期固醇含量增加
- 组合过表达ERG1和ERG11使鲨烯从10.6降至3.2（约3倍），总固醇含量比单独tHMG1菌株高1.9倍，比野生型高3倍
- 多数固醇积累发生在甾醇酯部分，游离甾醇基本不变
- 洛伐他汀处理可降低鲨烯、羊毛固醇和4,4-二甲基酵母固醇的水平
- 其他基因过表达如ERG27增加羊毛固醇，ERG5降低表酵母固醇并积累未知中间体。
研究结论
酿酒酵母中至少三个步骤控制多余固醇的合成：HMG-CoA还原酶、鲨烯环氧化酶Erg1p和羊毛固醇14α-脱甲基酶Erg11p。组合过表达ERG1和ERG11及截短HMG1可显著提高总固醇含量，达到野生型的3倍。