Tomato Fruits—A Platform for Metabolic Engineering of Terpenes
- 作者
- M. Gutensohn, N. Dudareva
- 单位
- Davis College of Agriculture, Natural Resources and Design, West Virginia University; Purdue University
- 杂志
- Methods in Enzymology（2016）
- DOI
- 10.1016/bs.mie.2016.03.012
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在植物中高效生产萜类化合物，同时避免在营养组织中表达工程基因对植株生长和光合作用造成的负面影响。番茄果实系统被开发为平台，利用果实成熟期高活性的MEP途径提供前体，并通过果实特异性启动子限制转基因表达。
研究策略
利用果实特异性启动子（E8、fibrillin、PG）在成熟番茄果实中稳定或瞬时表达萜类生物合成基因（MEP/MVA途径基因、异戊烯基转移酶、萜烯合酶），并通过杂交堆叠多个基因以协同提高目标萜类产量。
核心内容
该研究将番茄果实开发为萜类代谢工程平台，利用果实成熟期高活性的MEP途径提供前体，并通过E8、fibrillin等果实特异性启动子限制转基因表达，避免工程对营养组织生长和光合作用造成负面影响。研究者稳定或瞬时表达了MEP/MVA途径基因、异戊烯基转移酶和多种萜烯合酶，并通过杂交堆叠多个基因协同提高目标产物产量。结果显示，表达大肠杆菌DXS使DXS活性提高2倍、类胡萝卜素含量提高1.6倍；表达罗勒GES产生香叶醇及其衍生物约3500 ng/g FW；表达LIS产生S-芳樟醇及其衍生物400–800 ng/g FW；在yellow flesh突变体中表达紫杉二烯合酶，紫杉二烯积累量达400–600 μg/g DW。GPPS-SSU与GES共表达使单萜总产量提高3倍以上，香叶醇释放增加7倍；NDPS1与PHS1共表达还能产生β-水芹烯等新单萜。该平台结合果实特异性启动子和多基因堆叠策略，可在不影响植株生长的前提下实现单萜、倍半萜和二萜的高水平生产，并支持瞬时表达分析和规模化生物反应器应用。
创新点
1. 以番茄果实作为萜类代谢工程的平台，利用果实成熟期旺盛的MEP途径前体供应；2. 使用果实特异性启动子避免工程对营养组织生长的负面影响；3. 通过表达GPPS小亚基（GPPS-SSU）和NDPS1调控GPP/NPP前体供应；4. 通过杂交堆叠多个生物合成基因实现单萜、倍半萜和二萜的高水平生产；5. 建立农杆菌注射果实进行瞬时表达的方法，快速评估基因功能。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄果实 | MEP途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，在fibrillin启动子控制下表达，提高MEP途径通量 |
| 番茄果实 | MVA途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 来自拟南芥，在CaMV 35S启动子控制下表达，提高植物甾醇含量 |
| 番茄果实 | 单萜生物合成 | GPPS-SSU | 香叶基二磷酸合酶小亚基 | 调控 | 来自金鱼草，非催化亚基，通过与内源GGPPS互作改变产物特异性以增加GPP供给 |
| 番茄果实 | 单萜生物合成 | NDPS1 | 橙花基二磷酸合酶1 | 催化 | 来自番茄，催化形成NPP（顺式GPP），在PG启动子控制下表达 |
| 番茄果实 | 单萜生物合成 | LIS | S-芳樟醇合酶 | 催化 | 来自Clarkia breweri，在E8启动子控制下表达，产生S-芳樟醇 |
| 番茄果实 | 单萜生物合成 | GES | 香叶醇合酶 | 催化 | 来自罗勒，在PG启动子控制下表达，产生香叶醇及其衍生物 |
| 番茄果实 | 单萜生物合成 | PHS1 | 水芹烯合酶1 | 催化 | 来自番茄，同时利用NPP和GPP，在PG启动子控制下表达 |
| 番茄果实 | 倍半萜生物合成 | ZIS | α-姜烯合酶 | 催化 | 来自罗勒，在PG启动子控制下表达，产生α-姜烯等倍半萜 |
| 番茄果实 | 二萜生物合成 | TXS | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 来自红豆杉，在CaMV 35S或PG启动子控制下表达，在yellow flesh突变体中生产紫杉二烯 |
| 番茄果实 | 类胡萝卜素生物合成 | GGPPS2 | 香叶基香叶基二磷酸合酶2 | 催化 | 内源基因，在成熟果实中高表达，为番茄红素合成提供GGPP；NDPS1表达后其转录水平提高2.5倍 |
关键发现
- 表达大肠杆菌DXS使番茄果实DXS活性提高2倍，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸含量提高2倍，类胡萝卜素含量提高1.6倍
- 过表达拟南芥HMGR使成熟果实植物甾醇含量提高达2.4倍
- 表达金鱼草GPPS-SSU产生香叶醇、香叶醛、橙花醛等单萜，但番茄红素水平严重降低
- 表达番茄NDPS1产生大量橙花醇，且GGPPS2转录本水平提高2.5倍，番茄红素严重降低
- 表达LIS（芳樟醇合酶）产生S-芳樟醇及其衍生物400-800 ng/g FW，类胡萝卜素和生育酚不受影响
- 表达罗勒GES产生香叶醇及其衍生物约3500 ng/g FW，番茄红素降低50%
- 表达番茄PHS1仅产生约50 ng/g FW的月桂烯和罗勒烯
- 表达罗勒α-姜烯合酶（ZIS）产生α-姜烯等倍半萜，最高达1000 ng/g FW
- 在yellow flesh突变体中表达红豆杉紫杉二烯合酶，果实特异性启动子驱动下紫杉二烯积累量达400-600 μg/g DW，组成型启动子驱动下为140-400 μg/g DW
- GPPS-SSU与GES共表达使单萜总产量比亲本GES系提高3倍以上，香叶醇释放增加7倍；GPPS-SSU与PHS1共表达使月桂烯和罗勒烯释放增加2倍以上，内部库分别增加3.8倍和8倍；NDPS1与PHS1共表达产生β-水芹烯等新单萜。
研究结论
番茄果实系统是一个高效、安全的萜类代谢工程平台，通过果实特异性启动子和多基因堆叠策略可在不影响植株生长的前提下实现单萜、倍半萜和二萜的高水平生产。该平台还可用于瞬时表达分析和生物反应器规模化生产。未来结合组学方法理解‘沉默代谢’将提高工程的可预测性。