Translational Arrest Due to Cytoplasmic Redox Stress Delays Adaptation to Growth on Methanol and Heterologous Protein Expression in a Typical Fed-Batch Culture of Pichia pastoris
- 作者
- Bryn Edwards- Jones, Rochelle Aw, Geraint R. Barton, Gregory D. Tredwell, Jacob G. Bundy, David J. Leak
- 单位
- Department of Life Sciences, Faculty of Natural Sciences, Imperial College London; Department of Surgery & Cancer, Faculty of Medicine, Imperial College London; Department of Biology & Biochemistry, University of Bath
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0119637
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
解析毕赤酵母（Komagataella phaffii）在典型甲醇补料分批培养中，外源蛋白（人胰蛋白酶原）表达和甲醇适应延迟的分子机制，发现细胞质氧化还原失衡导致翻译停滞，而非此前认为的分泌应激/UPR。
研究策略
利用定制微阵列芯片和NMR代谢组学，对野生型GS115、TRY1-1（1拷贝）和TRY1-3（3拷贝）菌株在甲醇诱导前后0、2、4小时（部分至24小时）进行转录组和代谢物动态分析，结合试管培养比较UPR水平。
核心内容
本研究以毕赤酵母（Komagataella phaffii）为对象，系统解析了典型甲醇补料分批培养中外源蛋白表达与甲醇适应延迟的分子机制。通过定制微阵列芯片和NMR代谢组学，对野生型GS115及携带1拷贝（TRY1-1）或3拷贝（TRY1-3）人胰蛋白酶原基因的菌株在甲醇诱导前后进行转录组和代谢物动态分析。结果显示，试管培养中TRY1-3上清胰蛋白酶原产量仅为TRY1-1的约50%，且HAC1表达高3–4倍；但在补料分批培养中，TRY1-3诱导后至少24小时内几乎无生物量增加，且未显著诱导UPR，反而出现AOX1表达在2小时内上升约8倍。代谢组学显示TRY1-3积累更高水平阿拉伯醇和海藻糖，甲酸峰值延迟并出现胞内乳酸积累，提示细胞质-线粒体氧化还原失衡。研究首次表明，高代谢负荷与碳源转换压力叠加诱发的细胞质氧化还原应激可导致暂时性翻译停滞，而非此前认为的分泌应激/UPR，该现象易被误判且显著降低异源蛋白产量并延缓甲醇适应。
创新点
首次在毕赤酵母中表征了由瞬时代谢失衡引起的细胞质氧化还原应激可导致翻译停滞，并延迟甲醇适应和外源蛋白生产；表明该现象易被误判为UPR/分泌应激。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 (Komagataella phaffii) | 甲醇代谢 | AOX1 | 醇氧化酶 | 催化 | 甲醇诱导强启动子，控制外源蛋白表达；诱导后2h内表达量上升约8倍 |
| Pichia pastoris GS115 (Komagataella phaffii) | 甲醇代谢 | FDH1 | 甲酸脱氢酶 | 催化 | 参与甲醇氧化产生NADH，甲酸氧化相关的关键酶 |
| Pichia pastoris GS115 (Komagataella phaffii) | 未折叠蛋白反应 | HAC1 | Hac1p | 调控 | UPR转录因子；TRY1-1诱导后2h表达增加约5倍，TRY1-3无明显诱导 |
| Pichia pastoris GS115 (Komagataella phaffii) | 外源蛋白表达 | TRY1 | 人胰蛋白酶原 | 催化 | 重组基因；3拷贝菌株在试管中产量约为1拷贝的50%，HAC1表达高3-4倍 |
| Pichia pastoris GS115 (Komagataella phaffii) | 蛋白质分泌/ER加工 | SEC61 | Sec61p | 转运 | ER易位子核心蛋白；甲醇切换后表达下调 |
| Pichia pastoris GS115 (Komagataella phaffii) | 过氧化物酶体生物发生 | PEX3 | Pex3p | 区室化 | 过氧化物酶体膜蛋白合成及早期生物发生必需 |
| Pichia pastoris GS115 (Komagataella phaffii) | 糖异生/能量代谢 | PCK1 | 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 | 催化 | 糖异生关键酶，甲醇适应过程中下调 |
关键发现
- 试管培养中，3拷贝TRY1菌株上清胰蛋白酶原表达量约为1拷贝菌株的50%，且HAC1表达较1拷贝高3-4倍。补料分批培养中，TRY1-3菌株甲醇添加后至少24h内几乎无生物量增加
- AOX1表达在诱导后2h内上升约8倍
- TRY1-1菌株HAC1在诱导后2h内上升约5倍，而GS115几乎不变
- TRY1-3未显著诱导UPR。代谢组显示TRY1-3积累更高水平阿拉伯醇和海藻糖，甲酸峰值延迟，并出现胞内乳酸积累，提示细胞质-线粒体氧化还原失衡。
研究结论
标准甲醇补料分批诱导工艺中，外源蛋白生产导致的高代谢负荷与碳源转换引起的代谢压力叠加，诱发细胞质氧化还原失衡，导致暂时性且可能选择性的翻译停滞，从而降低异源蛋白产量并延缓甲醇适应。