Identification of Enzymes Involved in Sesterterpene Biosynthesis in Marine Fungi
- 作者
- Jingjing Yan, Jingjing Guo, Wei Yuan, Wanying Mai, Kui Hong
- 单位
- Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education, and Wuhan University School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan, China
- 杂志
- Methods in Enzymology（2018）
- DOI
- 10.1016/bs.mie.2018.04.023
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
海洋真菌中参与 C25 骨架 sesterterpene（如 ophiobolin）生物合成的酶及其基因的鉴定方法
研究策略
以 Aspergillus ustus 094102 为对象，通过全基因组测序与生物信息学挖掘（BLASTP、antiSMASH 等）预测萜烯合成酶基因，再采用体内基因/基因簇敲除、回补以及体外重组蛋白表达和酶促反应验证，结合 HPLC 和 GC-MS 检测产物来鉴定功能
核心内容
本研究以海洋真菌Aspergillus ustus 094102为对象，系统鉴定了参与C25骨架二倍半萜ophiobolin生物合成的关键酶。通过对40.09 Mb基因组进行测序组装，预测到13,982个蛋白编码基因，并利用antiSMASH及保守基序筛选获得11个萜烯基因簇和27个推定萜烯合酶基因。体内基因敲除实验表明，ΔPOC8003突变体完全丧失ophiobolin产量，证明Au8003为该化合物合成的关键基因；ΔPOC6298突变体使ophiobolin产量显著增加，而ΔPOC3446等突变体则导致产量显著下降；drimane产量在多个突变体中出现相反变化趋势，暗示生物合成途径存在分支调控。回补实验证实Au3446功能可恢复至近野生型水平。体外实验中，通过大肠杆菌BL21 (DE3)表达纯化Au8003、Au13192和Au6298重组蛋白，验证了其酶催化活性。该研究首次证明ophiobolin生物合成涉及多个基因簇协同作用，建立了一套从基因组挖掘、体内基因编辑到体外生化验证的完整技术流程，为鉴定新型萜烯合酶及解析复杂萜类代谢网络提供了可靠方法。
创新点
系统整合了基因组测序、生物信息学、体内基因编辑和体外生化验证的完整流程，首次证明 ophiobolin 的生物合成涉及多个基因簇，并鉴定了多个功能未知的双功能萜烯合酶（如 Au8003、Au13192、Au6298）
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus ustus 094102 | 萜类生物合成（sesterterpene/ophiobolin 生物合成） | Au8003 | Au8003 (推定的二萜合酶/双功能萜烯合酶) | 催化 | 基因簇 POC8003 敲除后 ophiobolin 产量完全消失，是关键酶 |
| Aspergillus ustus 094102 | 萜类生物合成（sesterterpene/ophiobolin 生物合成） | Au13192 | Au13192 (推定的二萜合酶/双功能萜烯合酶) | 催化 | POC13192 敲除使 ophiobolin 产量下降 (P<0.05) |
| Aspergillus ustus 094102 | 萜类生物合成（sesterterpene/ophiobolin 生物合成） | Au6298 | Au6298 (推定的萜烯合酶，功能未知) | 催化 | POC6298 敲除使 ophiobolin 产量增加 (P<0.05)，但 drimane 产量下降 (P<0.01) |
| Aspergillus ustus 094102 | 萜类生物合成（sesterterpene/ophiobolin 生物合成） | Au3446 | Au3446 (假定萜烯合酶) | 催化 | 单独敲除 Au3446 使 ophiobolin 产量部分降低，回补后恢复，表明其部分参与 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 萜类生物合成 | Au8003, Au13192, Au6298 | 重组 Au8003, Au13192, Au6298 蛋白 | 催化 | 用于体外酶活验证的异源表达宿主 |
关键发现
- Aspergillus ustus 094102 基因组大小为 40.09 Mb，由 301 个 contigs 和 174 个 scaffolds 组装而成，预测含 13,982 个蛋白编码基因，通过 antiSMASH 预测到 11 个萜烯基因簇，并利用保守基序（DDXX(D/E) 和 NSE/DTE）手工筛选到 27 个推定萜烯合酶基因。体内敲除实验表明：ΔPOC8003 突变体完全丧失了 ophiobolin 的产量
- ΔPOC6298 突变体使 ophiobolin 产量显著增加（P<0.05）
- ΔPOC3446（P<0.01）、ΔPOC13192（P<0.05）和 ΔPOC11565（P<0.05）突变体使 ophiobolin 产量显著下降
- drimane 产量在 ΔPOC6298 中显著下降（P<0.01），而在 ΔPOC3446、ΔPOC8003、ΔPOC11565 和 ΔPOC13192 中显著增加。Au3446 基因敲除后 sesterterpene 产量部分降低但未完全消除，回补后恢复到近野生型水平。体外实验通过 E. coli BL21 (DE3) 表达纯化 Au8003、Au13192 和 Au6298 并验证了其酶功能。
研究结论
海洋真菌 A. ustus 094102 中 sesterterpene ophiobolin 的生物合成由多个基因簇共同参与，其中 Au8003 是关键基因；本文提供了一套从基因组挖掘、体内基因编辑到体外酶功能验证的完整方法，可用于鉴定新型萜烯合酶。