Isopentenyldiphosphate and dimethylallyl diphosphate/isopentenyldiphosphate ratio measured with recombinant isopentenyldiphosphate isomerase and isoprene synthase
- 作者
- Changfang Zhou, Ziru Li, Amy E. Wiberley-Bradford, Sean E. Weise, Thomas D. Sharkey
- 单位
- School of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210093, China; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA; USDA-ARS-Vegetable Crops Research Unit, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706, USA
- 杂志
- Analytical Biochemistry（2013）
- DOI
- 10.1016/j.ab.2013.05.028
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
难以直接测量细胞内异戊烯基二磷酸（IDP）及其异构体二甲基烯丙基二磷酸（DMADP）的浓度和比例，现有方法只能分别测定总量或单一物质，缺乏同时定量 IDP 和 DMADP 并计算比值的方法。
研究策略
利用重组 IDP 异构酶（IDI）和异戊二烯合酶（IspS）耦联反应，将 IDP 经 IDI 异构化为 DMADP，再经 IspS 转化为异戊二烯，通过化学发光检测异戊二烯量；分别测 DMADP（只加 IspS）和 DMADP+IDP（同时加 IDI 和 IspS），差值即 IDP，从而确定 DMADP/IDP 比值。
核心内容
本研究建立了一种基于重组异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）和异戊二烯合酶（IspS）的酶耦联化学发光检测法，用于分别定量异戊烯基二磷酸（IDP）及其异构体二甲基烯丙基二磷酸（DMADP）并计算二者比值。该方法先仅加入IspS测定DMADP，再同时加入IDI和IspS测定DMADP与IDP总量，差值即为IDP含量。体外平衡实验测得DMADP/IDP比值为2.11（37°C和15°C一致）。将该方法应用于大肠杆菌和葛藤叶片，发现过表达MEP途径基因的大肠杆菌中DMADP池增至野生型的8-9倍、IDP池增至5-7倍，比值高达3.85；而仅含IspS的菌株比值为1.05，野生型FM5菌株为2.80。葛藤光适应叶片中比值为2.04，暗适应为2.32，且约90%的IDP+DMADP来自叶绿体，表现出光依赖性。该方法灵敏且能区分两种底物，为深入理解异戊二烯生物合成调控及代谢工程改造提供了有力工具。
创新点
['开发了一种新的酶耦联化学发光法，可分别定量 IDP 和 DMADP 并计算比值', '首次利用重组 IDI 和 IspS 测定体外 DMADP/IDP 平衡比为 2.11', '将该方法应用于大肠杆菌和葛藤叶片，揭示了体内 DMADP/IDP 比值与体外平衡比的异同', '通过光/暗处理区分了叶绿体和细胞质中的 DMADP/IDP 池']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli FM5 | MEP 途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 (IDI) | 催化 | 重组表达并纯化，催化 IDP 和 DMADP 的异构化 |
| Escherichia coli FM5 | MEP 途径 | ispS | 异戊二烯合酶 (IspS) | 催化 | 催化 DMADP 裂解生成异戊二烯 |
| Escherichia coli FM5 | MEP 途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | MEP 途径第一个酶，转化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生成 DXP |
| Escherichia coli FM5 | MEP 途径 | dxr | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 (DXR) | 催化 | MEP 途径第二个酶，将 DXP 转化为 MEP |
| Escherichia coli FM5 | MEP 途径 | mct | MEP 胞苷转移酶 (MCT) | 催化 | 催化 MEP 与 CTP 反应生成 CDP-ME |
| Escherichia coli FM5 | MEP 途径 | cmk | 4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 (CMK) | 催化 | 磷酸化 CDP-ME 生成 CDP-MEP |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 异戊二烯生物合成 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 (IDI) | 催化 | 用于重组表达 poplar IDI，His 标签纯化 |
关键发现
- 体外平衡 DMADP/IDP 比为
- 11:1（37°C 和 15°C 一致）；E. coli 中过表达 MEP 途径基因后，DMADP 和 IDP 池显著增加（DMADP 为野生型的 8-9 倍，IDP 为 5-7 倍），DMADP/IDP 比值高达
- 85；仅含 IspS 的 E. coli 菌株 DMADP/IDP 比为
- 05；野生型 FM5 菌株的比值为
- 80（比体外高 33%）；葛藤光适应叶片中 DMADP/IDP 比为
- 04，暗适应为
- 32；光适应叶片中约 90% 的 IDP+DMADP 来自叶绿体（光依赖）；DMADP 回收率
- 3%，IDP 回收率
- 0%。
研究结论
该研究建立了一种灵敏、可区分 IDP 和 DMADP 的酶耦联化学发光检测法，体外平衡比为 2.11，并成功应用于大肠杆菌和植物叶片中 DMADP/IDP 比值的测定。该方法有助于深入理解异戊二烯生物合成调控及指导代谢工程改造。