Regioselectivity of taxoid-O-acetyltransferase: heterologous expression and characterization of a new taxadien-5α-O-acetyltransferase
- 作者
- MyDoanh Chau, Kevin Walker, Robert Long, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340, USA
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2004）
- DOI
- 10.1016/j.abb.2004.07.013
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析红豆杉（Taxus）中taxoid乙酰转移酶的底物选择性和区域选择性，揭示新克隆TAX19的功能及其在紫杉醇生物合成和乙酰化taxoid副产物生成中的潜在作用。
研究策略
从Taxus EST文库中筛选新的酰基转移酶克隆，在大肠杆菌中异源表达，通过功能筛选、部分纯化、酶动力学分析、产物结构鉴定（NMR、GC-MS）以及序列比对，比较TAX1与TAX19等乙酰转移酶的催化特性。
研究路线图
创新点
发现并鉴定了一个新的taxadien-5α-O-乙酰转移酶TAX19，并首次揭示TAX1与TAX19对多羟基化taxoid底物具有不同的区域选择性（TAX1偏好C9/C10，TAX19偏好C5/C13），为理解taxoid代谢分支和紫杉醇产量优化提供了新靶点。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 紫杉醇生物合成 | TAX19 | taxadien-5α-O-乙酰转移酶 | 催化 | 新克隆的乙酰转移酶，异源表达于E. coli，催化taxadien-5α-ol的C5乙酰化，偏好C5/C13位 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 紫杉醇生物合成 | TAX1 | taxadien-5α-O-乙酰转移酶 | 催化 | 先前鉴定的5α-O-乙酰转移酶，对多羟基化taxoid偏好C9/C10位乙酰化 |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成 | TAX6 | 10-脱乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰转移酶 | 催化 | 催化10-DAB的C10乙酰化，也可乙酰化taxadien-5α,9α,10β,13α-四醇 |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成 | TAX14 | taxadien-5α,13α-二醇/5α,10β-二醇乙酰转移酶 | 催化 | 来自Taxus EST文库的新酰基转移酶，与TAX19高度同源 |
| Taxus cell cultures | 紫杉醇生物合成 | — | — | — | 研究背景生物，taxoid代谢产物的来源植物 |
关键发现
- TAX19对taxadien-5α-ol的K_M为5.0±0.3 μM，k_cat为29.59 s⁻¹，催化效率k_cat/K_M为5.92 μM⁻¹·s⁻¹
- TAX1对应K_M为8.6±0.5 μM，k_cat为4.28 s⁻¹，k_cat/K_M为0.50 μM⁻¹·s⁻¹。TAX19对乙酰辅酶A的K_M为5.2±2.5 μM。TAX1对taxadien-5α,9α,10β,13α-tetraol的产物分布为：9-OAc 25%，10-OAc 55%，9,10-diOAc 20%
- TAX19主要生成13-OAc产物。TAX19对taxadien-2α,5α,10β-triol的K_M为12.9±1.0 μM，k_cat为27.92 s⁻¹，k_cat/K_M为2.17 μM⁻¹·s⁻¹
- TAX1对该底物无C5乙酰化活性。1L大肠杆菌培养可产生约5mg TAX19部分纯化酶（60%纯度），TAX1约1mg（40%纯度）。TAX19与TAX1的序列相似性为77%，同一性为61%
- TAX19与TAX14的相似性为93%，同一性为87%。
研究结论
TAX19是一种新的taxadien-5α-O-乙酰转移酶，与已知TAX1共同催化紫杉醇生物合成早期的C5乙酰化步骤；TAX19底物谱更广，对多羟基化taxoid具有更包容的区域选择性，可能负责多种乙酰化taxoid的生成，是抑制旁路代谢、提高紫杉醇通量的潜在改造靶点。