Characterization of santalene synthases using an inorganic pyrophosphatase coupled colorimetric assay
- 作者
- Gaoqun Hua, Yiling Hu, Chunyu Yang, Dazhi Liu, Zhuo Mao, Lixin Zhang, Yan Zhang
- 单位
- Tianjin Key Laboratory for Modern Drug Delivery & High-Efficiency, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering, School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University; School of Biotechnology, East China University of Science and Technology
- 杂志
- Analytical Biochemistry（2018）
- DOI
- 10.1016/j.ab.2018.02.002
- 所属领域
- 代谢工程/酶学分析
- 关键词
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解决的核心问题
现有GC-MS等方法表征萜烯合酶活性存在耗时长、成本高、需标准品、低浓度产物难以定量等问题，且文献中檀香烯合酶（如SaSSy）的动力学参数存在巨大争议（kcat相差达40倍）。
研究策略
开发一种以酵母无机焦磷酸酶（IPP1）为偶联酶的比色法：IPP1将萜烯合酶催化反应副产物焦磷酸水解为正磷酸，正磷酸与钼酸铵反应生成蓝色化合物，通过测定A660定量焦磷酸，从而反映萜烯合酶活性。
核心内容
针对萜烯合酶传统活性测定方法耗时且成本高、文献中檀香烯合酶动力学参数争议较大的问题，本研究开发了一种以酵母无机焦磷酸酶（IPP1）为偶联酶的比色法。该方法将萜烯合酶催化副产物焦磷酸水解为正磷酸，再与钼酸铵反应显色，通过测定A660定量酶活性，并借助冻干浓缩反应液提高了灵敏度。利用该方法测定了三种檀香烯合酶的动力学参数：SaSSy的kcat为4.4±0.2 min⁻¹、Km为2.7±0.9 μM，SspiSSy的kcat为6.4±0.2 min⁻¹、Km为2.0±0.4 μM，SanSyn的kcat为4.5±0.2 min⁻¹、Km为1.5±0.4 μM，且SanSyn的α-檀香烯产物占比超过90%，约为另外两种酶的3倍。该方法与GC-MS测定结果一致，在350 μL反应体系中测得焦磷酸为11.5±0.5 nmoles，与GC-MS测得的产物总量12.5±0.1 nmoles相符。该比色法准确、灵敏、成本低且无需标准品，可推广至其他萜烯合酶及异戊烯基转移酶的研究，并为解决动力学参数争议提供可靠手段。
创新点
首次将IPP1偶联比色法用于檀香烯合酶动力学表征；通过冻干浓缩反应液提高灵敏度，解决了低底物浓度下产物难以检测的问题；无需昂贵仪器和商品化标准品，适用于高通量筛选。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜类生物合成（檀香油生物合成） | SaSSy | 檀香烯合酶SaSSy | 催化 | 来自檀香（Santalum album），催化FPP生成α-檀香烯、α-外型-佛手柑烯、表-β-檀香烯和β-檀香烯 |
| Escherichia coli ArcticExpress | 萜类生物合成（檀香油生物合成） | SspiSSy | 檀香烯合酶SspiSSy | 催化 | 来自大果檀香（Santalum spicatum），与SaSSy具有95%序列同一性 |
| Escherichia coli ArcticExpress | 萜类生物合成（檀香油生物合成） | SanSyn | 檀香烯合酶SanSyn | 催化 | 来自山小橘（Clausena lansium），主要产物为α-檀香烯（>90%） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 焦磷酸代谢 | IPP1 | 无机焦磷酸酶IPP1 | 催化 | 来自酿酒酵母，作为偶联酶水解焦磷酸为正磷酸，比活力400 units/mg |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | SanSyn | 檀香烯合酶SanSyn | 催化 | 用于构建工程菌Santa 1.0生产α-檀香烯标准品 |
关键发现
- 建立了焦磷酸标准曲线（1-60 μM），斜率是磷酸标准曲线的2倍
- 测定了三个檀香烯合酶的动力学参数：SaSSy kcat=4.4±0.2 min^-1，Km=2.7±0.9 μM
- SspiSSy kcat=6.4±0.2 min^-1，Km=2.0±0.4 μM
- SanSyn kcat=4.5±0.2 min^-1，Km=1.5±0.4 μM
- SanSyn的α-檀香烯产物占>90%，约为SaSSy/SspiSSy的3倍
- IPP1偶联法与GC-MS法结果一致，在350 μL反应体系中测得的焦磷酸为11.5±0.5 nmoles，GC-MS测得四种主要产物总量为12.5±0.1 nmoles
- 发酵提取的α-檀香烯标准品浓度为1340±6 mM。
研究结论
IPP1偶联比色法是一种准确、灵敏、低成本且环境友好的萜烯合酶活性测定方法，可用于解决文献中动力学参数争议，并可推广至其他萜烯合酶和异戊烯基转移酶的研究及抑制剂高通量筛选。