Isoprenoid biosynthesis in Artemisia annua: Cloning and heterologous expression of a germacrene A synthase from a glandular trichome cDNA library
- 作者
- Cinzia M. Bertea, Alessandra Voster, Francel W.A. Verstappen, Massimo Maffei, Jules Beekwilder, Harro J. Bouwmeester
- 单位
- Plant Research International, P.O. Box 16, 6700 AA Wageningen, The Netherlands; Department of Plant Biology and Centre of Excellence CEBIOVEM, University of Turin, Viale P. A. Mattioli, 25 I-10125 Turin, Italy
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2006）
- DOI
- 10.1016/j.abb.2006.02.026
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从青蒿腺毛中克隆并鉴定参与萜类（包括青蒿素前体）生物合成的关键酶基因，特别是香叶烯A合酶，以阐明异戊二烯生物合成途径。
研究策略
采用玻璃珠研磨法分离青蒿腺毛分泌细胞，提取RNA构建质粒cDNA文库；随机测序约900个克隆进行EST分析，筛选异戊二烯生物合成相关候选基因；对候选香叶烯A合酶基因进行全长测序、系统进化分析，并在大肠杆菌中异源表达以验证功能。
核心内容
该研究通过玻璃珠研磨法从青蒿腺毛分泌细胞中提取RNA并构建质粒cDNA文库，随机测序约900个克隆获得765条高质量EST，平均长度约600 bp，组装成459个contigs，其中约8%与异戊二烯生物合成相关。分析显示腺毛中同时存在MEP和MVA途径的关键酶基因如DXS、HMGR及紫穗槐-4,11-二烯合酶。研究克隆了全长1686 bp的香叶烯A合酶基因AaGAS，编码562个氨基酸，与菊苣和莴苣的同源酶相似性达81%。在大肠杆菌BL21(DE3)-RIL中异源表达后，重组蛋白以法尼基二磷酸为底物生成单一产物香叶烯A，在GC-MS进样口重排为β-elemene，且不利用香叶基二磷酸。完整腺体实验中放射性标记FDP可转化为紫穗槐-4,11-二烯和香叶烯A，证实腺毛是萜类合成与储存的重要场所。该研究首次从腺毛特异性文库克隆并功能验证香叶烯A合酶，为解析青蒿素生物合成途径及后续代谢工程改造奠定了基础。
创新点
首次从青蒿腺毛特异性cDNA文库中克隆香叶烯A合酶基因；证明腺毛是青蒿萜类生物合成研究的优良材料；通过EST分析揭示了腺毛中MEP和MVA途径的共存在。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 青蒿（Artemisia annua）腺毛分泌细胞 | 异戊二烯生物合成（MEP/MVA途径） | AaGAS | 香叶烯A合酶 | 催化 | 从腺毛cDNA文库克隆，催化FDP环化生成香叶烯A |
| 大肠杆菌BL21(DE3)-RIL | 倍半萜生物合成 | AaGAS | 香叶烯A合酶 | 催化 | 异源表达验证其催化FDP生成单一产物香叶烯A |
| 青蒿腺毛分泌细胞 | MEP途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | EST分析发现3个克隆 |
| 青蒿腺毛分泌细胞 | MVA途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | EST分析发现1个克隆 |
| 青蒿腺毛分泌细胞 | 倍半萜生物合成 | amorpha-4,11-diene synthase | 紫穗槐-4,11-二烯合酶 | 催化 | 青蒿素生物合成第一步关键酶，EST分析发现1个克隆 |
关键发现
- 从青蒿腺毛cDNA文库中随机测序900个克隆，获得765条高质量EST，平均长度约600 bp，组装成459个contigs
- 与异戊二烯生物合成相关的EST约占8%。克隆到全长香叶烯A合酶（AaGAS），其ORF长1686 bp（正文中为1689 bp），编码562个氨基酸。重组蛋白在大肠杆菌中表达后，以法尼基二磷酸（FDP）为底物生成单一产物香叶烯A（在GC-MS高温进样口重排为β-elemene），不利用香叶基二磷酸（GDP）。该酶与菊苣（Cichorium intybus）和莴苣（Lactuca sativa）的香叶烯A合酶相似性达81%。完整腺体实验中，放射性标记FDP可转化为amorpha-4,11-二烯和香叶烯A。
研究结论
青蒿腺毛是萜类生物合成和储存的重要场所，利用腺毛cDNA文库结合EST分析可高效克隆参与青蒿素等萜类生物合成的基因。本研究成功克隆并功能验证了香叶烯A合酶，该酶可能参与植物防御等生理功能，也为进一步解析青蒿素生物合成途径奠定了基础。