Structural and kinetics properties of a mutated phytoene desaturase from Rubrivivax gelatinosus with modified product specificity
- 作者
- Per Stickforth, Gerhard Sandmann
- 单位
- Molecular Biosciences 213, J.W. Goethe Universität, P.O. Box 111932, D-60054 Frankfurt, Germany
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2010）
- DOI
- 10.1016/j.abb.2010.09.021
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
八氢番茄红素脱氢酶CrtI在Rubrivivax gelatinosus中同时催化三步和四步脱氢反应，生成neurosporene和lycopene两种产物。如何通过突变改变其产物特异性，使其主要合成其中一种产物，并阐明结构与动力学性质的关系。
研究策略
采用易错PCR构建两个随机突变文库（强启动子pUC8和弱启动子pPEU），在E. coli中与pACCRT-EB共转化进行颜色筛选，获得产物特异性改变的CrtI突变体，通过序列分析、二级结构预测和酶动力学表征研究突变对底物特异性的影响。
核心内容
该研究通过易错PCR构建了Rubrivivax gelatinosus来源的八氢番茄红素脱氢酶CrtI随机突变文库，在E. coli中与pACCRT-EB共转化进行颜色筛选，获得了产物特异性改变的突变体。野生型CrtI催化三步和四步脱氢反应，产物neurosporene与lycopene的比率为88:12。筛选得到的突变体EP08（L208P）和EP21（P134L/V395A/T256M）几乎专一合成neurosporene（L:N分别为3:97和0:100），而EP05（L208F）则增强lycopene合成。动力学分析显示，EP05对phytoene的Km降至4.8 μM而Vmax不变，对neurosporene的Km升至65.8 μM且Vmax增至3.3 nmol mg⁻¹ h⁻¹；EP08对neurosporene的催化效率则显著降低。L208位于高度疏水的跨膜区域，该位点突变通过改变蛋白二级结构（螺旋缩短或延长）影响底物亲和力。研究表明，单个氨基酸替换即可在两种脱氢活性间切换产物特异性，为类胡萝卜素脱氢酶的工程化改造和分子进化提供了直接证据。
创新点
首次通过随机突变获得可特异性合成neurosporene或lycopene的CrtI突变体，鉴定出L208为关键氨基酸（L208P导致neurosporene积累，L208F增强lycopene合成），并证明突变通过影响蛋白二级结构（螺旋缩短/延长）改变底物亲和力。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | — | — | — | — | 表达宿主 |
| — | 类胡萝卜素生物合成 | crtE, crtB | GGPP合酶, 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 由pACCRT-EB编码，合成底物phytoene |
| — | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 来自Rubrivivax gelatinosus，野生型及突变体，催化phytoene脱氢生成neurosporene/lycopene |
关键发现
- 野生型CrtI在pUC8中L:N比率为88:12
- 突变体EP08(L208P)、EP16(Y44C/D53G)、EP21(P134L/V395A/T256M)、EP22(D355G/L424P)的L:N分别为3:97、3:97、0:100、12:88
- 从pPEU文库筛选的EP05(L208F)增强lycopene合成。动力学参数：野生型对phytoene的Km=14.8 μM，Vmax=5.2 nmol mg−1 h−1，对neurosporene的Km=33.1 μM，Vmax=0.6
- EP05对phytoene的Km=4.8 μM，Vmax=5.2，对neurosporene的Km=65.8 μM，Vmax=3.3
- EP08对phytoene的Km=17.1 μM，Vmax=5.4，对neurosporene的Km=41.7 μM，Vmax=0.3。Vmax/Km表明EP05对两种底物的特异性均升高，EP08对neurosporene的特异性降低。L208位于高度疏水的跨膜区域，可能是底物结合位点。
研究结论
通过改变CrtI的单个氨基酸（如L208）即可调控产物特异性，从几乎专一合成lycopene变为专一合成neurosporene，或反之。突变通过改变蛋白二级结构影响底物亲和力，为类胡萝卜素脱氢酶的进化提供了证据，可用于工程化改造合成特定类胡萝卜素。