Redesign of MST enzymes to target lyase activity instead promotes mutase and dehydratase activities
- 作者
- Kathleen M. Meneely, Qianyi Luo, Audrey L. Lamb
- 单位
- Department of Molecular Biosciences, University of Kansas, Lawrence, KS 66045, United States
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2013）
- DOI
- 10.1016/j.abb.2013.09.007
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
测试简单互换假说：是否可通过交换MST家族异分支酸合酶与邻氨基苯甲酸合酶（水杨酸合酶）的非保守活性位点残基来互换lyase活性，即给PchA增加lyase活性或从Irp9去除lyase活性。
研究策略
构建PchA和Irp9的单/双点突变体，利用稳态动力学、荧光检测和NMR时间过程追踪反应产物，并通过KinTek全局拟合获得速率常数，比较野生型和变体的活性谱。
核心内容
本研究以MST酶家族中异分支酸合酶PchA和水杨酸合酶Irp9为对象，检验简单互换非保守活性位点残基能否实现裂解酶活性的互换。通过构建单双点突变体，结合稳态动力学、荧光检测和NMR时间过程追踪产物，并用KinTek全局拟合获取速率常数。结果显示，T348A突变使Irp9水杨酸合酶活性降至不可测水平，裂解酶活性降低17倍至9,300 M⁻¹ s⁻¹；E281D使水杨酸合酶活性降低32倍至1,300 M⁻¹ s⁻¹。PchA的A375T突变使异分支酸合酶活性降低三个数量级至62 M⁻¹ s⁻¹，而D310E使裂解酶活性提高3倍。值得注意的是，突变并未实现裂解酶活性的互换，反而意外增强了分支酸变位酶和预苯酸脱水酶活性，如D310E-PchA的脱水酶活性增强240,000倍，WT-Irp9的变位酶活性增强77倍。NMR显示E281D/T348A-Irp9主要生成苯丙酮酸（85%）。这些结果支持了MST酶作为多功能“分支酸利用酶”的permute假说，并揭示了镁离子螯合残基侧链长度对活性的关键影响。
创新点
发现简单的残基互换不能实现lyase活性互换，而是意外促进了分支酸变位酶和预苯酸脱水酶活性，从而支持了'permute'假说；并揭示了镁离子螯合残基侧链长度的重要性。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | pyochelin 生物合成 | pchA | PchA | 催化 | 野生型异分支酸合酶，催化分支酸生成异分支酸，来源于铜绿假单胞菌 |
| Escherichia coli | yersiniabactin 生物合成 | irp9 | Irp9 | 催化 | 双功能水杨酸合酶，具有异分支酸合酶和异分支酸-丙酮酸裂解酶活性，来源于小肠结肠炎耶尔森菌 |
| Escherichia coli | pyochelin 生物合成 | pchB | PchB | 催化 | 异分支酸-丙酮酸裂解酶，用于偶联测定，来源于铜绿假单胞菌 |
| Escherichia coli | enterobactin 生物合成 | entC | EntC | 催化 | 异分支酸合酶，文中作为参照 |
| Escherichia coli | menaquinone 生物合成 | menF | MenF | 催化 | 异分支酸合酶，文中作为参照 |
| Escherichia coli | mycobactin 生物合成 | mbtI | MbtI | 催化 | 水杨酸合酶，来源于结核分枝杆菌，文中作为参照 |
| Escherichia coli | pyochelin 生物合成 | pchA | PchA D310E | 催化 | 将天冬氨酸替换为谷氨酸，改变镁离子螯合侧链长度 |
| Escherichia coli | pyochelin 生物合成 | pchA | PchA A375T | 催化 | 将丙氨酸替换为苏氨酸，影响底物羟基结合 |
| Escherichia coli | pyochelin 生物合成 | pchA | PchA D310E/A375T | 催化 | 双突变体 |
| Escherichia coli | yersiniabactin 生物合成 | irp9 | Irp9 E281D | 催化 | 谷氨酸替换为天冬氨酸 |
| Escherichia coli | yersiniabactin 生物合成 | irp9 | Irp9 T348A | 催化 | 苏氨酸替换为丙氨酸 |
| Escherichia coli | yersiniabactin 生物合成 | irp9 | Irp9 E281D/T348A | 催化 | 双突变体 |
关键发现
- WT Irp9的水杨酸合酶活性kcat/Km为42,000 M^-1 s^-1，异分支酸-丙酮酸裂解酶活性为159,000 M^-1 s^-1
- T348A突变使水杨酸合酶活性降至不可测水平，裂解酶活性降低17倍至9,300 M^-1 s^-1
- E281D突变使水杨酸合酶活性降低32倍(1,300 M^-1 s^-1)，裂解酶活性降低5倍。WT PchA异分支酸合酶活性为57,000 M^-1 s^-1，A375T使其降低三个数量级至62 M^-1 s^-1
- D310E突变使裂解酶活性提高3倍至50.4 M^-1 s^-1。NMR时间过程显示WT-Irp9主要生成水杨酸(82%)，而E281D/T348A-Irp9主要生成苯丙酮酸(85%)。D310E-PchA中预苯酸脱水酶活性增强240,000倍（相对于非酶反应），WT-Irp9的变位酶/脱水酶活性分别增强77倍和890倍。
研究结论
研究表明，试图通过交换非保守残基来互换lyase活性并未成功，反而增强了对分支酸变位酶和预苯酸脱水酶的旁路活性，支持了MST酶作为'chorismate-utilizing'酶能够催化多种反应的'permute'假说。