Promoter analysis of the Catharanthus roseus geraniol 10-hydroxylase gene involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis
- 作者
- Nitima Suttipanta, Sitakanta Pattanaik, Samir Gunjan, Claire H. Xie, John Littleton, Ling Yuan
- 单位
- Department of Plant and Soil Sciences, University of Kentucky; The Kentucky Tobacco Research and Development Center, University of Kentucky; Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky
- 杂志
- Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression（2007）
- DOI
- 10.1016/j.bbaexp.2007.01.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
分离并功能表征长春花(Catharanthus roseus)香叶醇10-羟化酶(G10H)基因启动子，阐明其调控元件及对茉莉酸甲酯和真菌诱导子的响应机制，为理解萜类吲哚生物碱(TIA)生物合成的转录调控提供基础。
研究策略
采用PCR-based genome walking分离G10H启动子，通过5'-RACE定位转录起始位点；构建5'和3'端系列缺失与GUS融合载体，在烟草原生质体中瞬时表达分析启动子活性；通过获得功能实验鉴定增强子区域；并利用转基因烟草和长春花毛状根验证组织特异性表达及对茉莉酸甲酯和真菌诱导子的响应。
核心内容
该研究分离并功能表征了长春花香叶醇10-羟化酶（G10H）基因约533 bp的启动子，旨在揭示萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的转录调控机制。通过PCR-based genome walking和5'-RACE分别获得启动子序列并定位转录起始位点，随后构建系列5'和3'端缺失的GUS融合载体，在烟草原生质体中瞬时表达测定活性。结果显示，缺失至-318 bp对启动子活性影响不大，但进一步缺失至-103 bp使GUS活性下降约5倍；获得功能实验鉴定出三个增强子区域（-191至-147、-266至-188和-318至-266），三者组合可使活性比全长启动子高约20%。该启动子在转基因烟草和长春花毛状根中驱动组织特异性表达，且100 μM茉莉酸甲酯使毛状根GUS活性增加8倍以上，酵母提取物也可诱导表达。启动子含有W-box、MYB、AT-box等多个顺式元件，提示G10H可能受不同于Tdc和Str的转录级联调控，且存在负调控元件，为理解TIA途径的差异化调控提供了新认识。
创新点
首次分离并功能表征长春花G10H基因启动子；发现启动子中存在多个独特的顺式元件(W-box、MYB、AT-box、P-box)及三个潜在的转录增强子区域；证据表明G10H启动子可能受不同于Tdc/Str的转录级联调控，并存在负调控元件。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | G10H | 香叶醇10-羟化酶 (G10H) | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶(CYP76B超家族)，催化香叶醇生成10-羟基香叶醇，为TIA生物合成第一个限速步骤。 |
| Nicotiana tabacum | — | GUS (uidA) | β-葡萄糖醛酸酶 | 催化 | 报告基因，用于评估启动子活性。 |
| Catharanthus roseus | 细胞色素P450还原系统 | Cpr | NADPH:细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为G10H提供电子，其启动子受GT-1调控，与G10H协同响应茉莉酸。 |
| Catharanthus roseus | 基因表达调控 | GT-1 | GT-1转录因子 | 调控 | 结合G10H启动子中的GT-1元件(6个潜在位点)。 |
| Catharanthus roseus | 基因表达调控 | Dof | Dof转录因子 | 调控 | G10H启动子含多个Dof结合核心序列(AAAG/CTTT)。 |
| Catharanthus roseus | 防御应答调控 | WRKY | WRKY转录因子 | 调控 | 结合W-box (TGACCT)，可能介导真菌诱导子响应。 |
| Catharanthus roseus | 基因表达调控 | MYB | MYB转录因子 | 调控 | MYB识别序列(TGGTTAG)存在于启动子。 |
关键发现
- 成功分离了约533 bp的G10H启动子
- 主要转录起始位点位于TATA盒下游31 bp处腺嘌呤。5'端缺失分析显示，缺失至-318 bp对启动子活性影响较小，但进一步缺失至-103 bp使GUS活性降低约5倍
- 全长启动子活性为1.32 nmol MU/min/mg蛋白。获得功能实验证实存在三个转录增强子区域：-191至-147、-266至-188和-318至-266，其中-266至-188区域使GUS活性达到与全长启动子相当水平，三个区域组合(-318至-147)使活性比全长启动子高约20%。启动子可驱动GUS在转基因烟草叶片和根尖旺盛生长细胞中表达，且在长春花毛状根和烟草幼苗中均受100 μM MeJA诱导(毛状根中GUS活性增加大于8倍)和酵母提取物诱导(0.5%、1%、1.5%酵母提取物分别使GUS活性增加约0.5、2、3倍)。
研究结论
G10H启动子核心区内含TATA-box及多个顺式调控元件，上游-318至-147区域对最大启动子活性至关重要且包含三个增强子，并存在负调控元件；该启动子赋予组织特异性表达并对MeJA和真菌诱导子响应，其独特的W-box、MYB、AT-box、P-box等元件提示G10H受不同于Tdc和Str的转录级联调控。