Insights into the functional properties of the marneral oxidase CYP71A16 from Arabidopsis thaliana
- 作者
- Sarah Kranz-Finger, Osama Mahmoud, Esther Ricklefs, Nikolas Ditz, Patrick J. Bakkes, Vlada B. Urlacher
- 单位
- Institute of Biochemistry, Heinrich-Heine University Düsseldorf; Cluster of Excellence on Plant Sciences, Heinrich-Heine University Düsseldorf
- 杂志
- BBA - Proteins and Proteomics（2017）
- DOI
- 10.1016/j.bbapap.2017.07.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
拟南芥三萜类化合物合成与修饰途径中CYP71A16（马尼醇氧化酶）的功能特性尚未被详细表征，需要建立异源表达和体外重组系统以研究其催化性质。
研究策略
在E. coli中异源表达N端改造的CYP71A16，纯化后与不同氧化还原伴侣重构体外催化体系，比较其支持CYP71A16活性的能力，并对马尼醇底物结合及稳态动力学进行表征。
核心内容
该研究在大肠杆菌中异源表达了N端改造的拟南芥CYP71A16（马尼醇氧化酶），纯化后获得约50 mg·L⁻¹的可溶蛋白，纯度约90%、回收率约80%。通过体外重构催化体系，比较了植物内源还原酶C-ATR2与细菌黄素氧还蛋白系统Fpr/YkuN对该酶活性的支持能力，发现Fpr/YkuN体系在20小时内驱动马尼醇转化率接近60%，远高于C-ATR2在1:4比例下仅7.8%的转化率，且其NADPH氧化速率达29 min⁻¹，为C-ATR2的5倍以上。动力学表征显示该酶对马尼醇的K_M为142.1±29.3 μM，k_cat为3.9 min⁻¹，底物结合常数K_D为225 μM，并表现出高度底物特异性。在2 μM酶催化下，180分钟内马尼醇消耗达98.5%，伴随一个m/z 514的过度氧化副产物生成。结果表明CYP71A16主要催化马尼醇羟基化生成23-羟基马尼醇，细菌Fpr/YkuN系统是更高效的氧化还原伴侣，为解析拟南芥鸢尾醛类三萜合成途径提供了关键酶学依据。
创新点
首次在大肠杆菌中高效表达并纯化了拟南芥CYP71A16（产量达50 mg·L⁻¹）；发现细菌黄素氧还蛋白系统Fpr/YkuN比植物内源还原酶ATR2更能有效支持CYP71A16的体外羟化活性；利用Triton X-100和Stage-Tip处理解决了疏水底物及去污剂与GC/MS兼容性的问题。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli C43 (DE3) | 三萜类化合物生物合成与修饰途径 | CYP71A16 | CYP71A16rab（N端改造的CYP71A16） | 催化 | 催化马尼醇羟化为23-羟基马尼醇，也能转化马尼醛；在大肠杆菌中表达量达50 mg·L⁻¹ |
| Escherichia coli C43 (DE3) | 电子传递链 | ATR2 | ATR2（C-ATR2，来自拟南芥Columbia生态型） | 调控 | 细胞色素P450还原酶，为CYP71A16提供电子；截短并带His标签后在大肠杆菌中表达，活性约1 U·mg⁻¹ |
| Bacillus subtilis | 电子传递链 | ykuN | YkuN（黄素氧还蛋白） | 转运 | FMN-黄素氧还蛋白，与Fpr构成异源氧化还原伴侣系统，支持CYP71A16活性 |
| Escherichia coli | 电子传递链 | fpr | Fpr（黄素氧还蛋白还原酶） | 转运 | FAD-黄素氧还蛋白还原酶，与YkuN一起将电子从NADPH传递给CYP71A16 |
| Escherichia coli | 电子传递链 | ykuN-fpr融合基因 | YkuN-Fpr融合蛋白（YR-P5） | 转运 | 通过刚性连接肽融合YkuN和Fpr的人工氧化还原伴侣，也支持CYP71A16活性但效率略低于分离体系 |
| Saccharomyces cerevisiae GIL-77 | 三萜类化合物生物合成途径 | MRN1 | Marneral合成酶 | 催化 | 用于生产底物马尼醇，从3 L酵母培养物中纯化获得9.1 mg马尼醇（纯度>98%） |
| Bacillus megaterium | 辅因子再生 | GDH | 葡萄糖脱氢酶 | 能量供给 | 用于NADPH再生系统（12 U·mL⁻¹，以葡萄糖为底物） |
| Arabidopsis thaliana | 三萜类化合物生物合成途径 | CYP705A12 | CYP705A12 | 催化 | 与CYP71A16同处一个基因簇，功能未知 |
关键发现
- CYP71A16rab在大肠杆菌中表达量最高可达50 mg·L⁻¹
- 纯化后纯度约90%，回收率约80%
- 以C-ATR2为氧化还原伴侣时，P450:ATR2为1:1和1:4时马尼醇转化率分别仅为1.3%和7.8%
- 以Fpr/YkuN为氧化还原伴侣时，20小时内马尼醇转化率接近60%
- YkuN-Fpr融合蛋白支持45%转化
- Fpr/YkuN体系的NADPH氧化速率为29 min⁻¹，C-ATR2为5.5 min⁻¹，YkuN-Fpr融合为11 min⁻¹
- 耦合效率均<1%（YkuN-Fpr融合为1%）
- 马尼醇与CYP71A16rab结合的K_D为225 μM
- 马尼醇羟化的K_M为142.1±29.3 μM，k_cat为3.9 min⁻¹
- 2 μM CYP71A16rab催化下180 min内马尼醇消耗98.5%，并出现一个m/z 514的过度氧化产物
- 未检测到CYP71A16rab与其他三萜类化合物的结合。
研究结论
成功实现了CYP71A16在大肠杆菌中的功能性异源表达和纯化，体外重构了其催化活性，并证明其主要将马尼醇羟化为23-羟基马尼醇。Fpr/YkuN细菌氧化还原系统比植物内源ATR2更高效地支持CYP71A16的活性。该酶对马尼醇具有较高的底物特异性，其动力学参数得到确定，为理解拟南芥中马尼醇氧化途径及鸢尾醛类三萜的生物合成提供了重要的功能信息。