Contribution of hydroxymethylbutenyl diphosphate synthase to carotenoid biosynthesis in bacteria and plants
- 作者
- Úrsula Flores-Pérez, Jordi Pérez-Gil, Antía Rodríguez-Villalón, María José Gil, Pablo Vera, Manuel Rodríguez-Concepción
- 单位
- Departament de Genética Molecular de Plantes, Consorci CSIC-IRTA, Jordi Girona 18, 08034 Barcelona, Spain; Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat de Barcelona, Av. Diagonal 645, 08028 Barcelona, Spain; Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP), UPV-CSIC, Camí de Vera s/n, 46022 Valencia, Spain
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（2008）
- DOI
- 10.1016/j.bbrc.2008.04.115
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究上调羟甲基丁烯基二磷酸合酶（HDS）水平是否能增加细菌和植物中 MEP 途径的代谢通量，以类胡萝卜素积累量为判断标准。
研究策略
在大肠杆菌和拟南芥中过表达 HDS，结合功能互补实验、实时定量 RT-PCR、免疫印迹和色素定量分析，评估 HDS 对类胡萝卜素生物合成的影响。
研究路线图
核心内容
该研究通过在大肠杆菌和拟南芥中过表达羟甲基丁烯基二磷酸合酶（HDS），系统评估了上调该酶对MEP途径代谢通量及类胡萝卜素积累的影响。在大肠杆菌BL21(DE3)中，携带pQE32-GcpE质粒过表达活性HDS后，即便经0.5 mM IPTG诱导并在37°C培养15小时，番茄红素积累量与空载体对照无显著差异；在拟南芥中，过表达HDS的转基因株系虽显著提高了HDS转录本和蛋白水平，但叶绿素和类胡萝卜素含量均未发生明显变化。与之对照，部分功能缺失的clb4-3突变体表现出淡色表型和色素减少，而过表达HDS可使其恢复至野生型水平。研究首次证明HDS并非MEP途径的限速酶，其活性上调不足以增加代谢通量，通量控制系数较低，与DXS、DXR和HDR等限速酶作用不同。这一发现为异戊二烯代谢工程的靶点选择提供了重要参考，提示在改造该途径时不应将HDS作为主要上调目标。
创新点
首次证明 HDS 不是 MEP 途径的限速酶，其活性上调不会增加细菌和植物中的类胡萝卜素积累，为代谢工程改造异戊二烯代谢提供了新认识。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | MEP 途径 | gcpE | HDS (GcpE/IspG) | 催化 | 通过 pQE32-GcpE 过表达，与 pACCRT-EIB 共转化，研究对番茄红素积累的影响 |
| 大肠杆菌 EcAB4-4 (gcpE::CAT) | MEP 途径 | gcpE | HDS (GcpE/IspG) | 催化 | 用于功能互补实验，验证重组 RGS-His-GcpE 的活性 |
| 拟南芥 Columbia-0 | MEP 途径 | At5g60600 | HDS | 催化 | 在野生型背景下过表达 HDS（35S:HDS），分析叶绿素和类胡萝卜素水平 |
| 拟南芥 clb4-3 | MEP 途径 | At5g60600 | HDS | 催化 | 部分功能缺失突变体，过表达 HDS 可恢复野生型表型 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 类胡萝卜素合成 | crtE, crtB, crtI | CrtE, CrtB, CrtI | 催化 | 来自 Erwinia uredovora，提供番茄红素合成报告系统 |
关键发现
- 在大肠杆菌 BL21(DE3) 中，用 pQE32-GcpE 过表达活性 HDS（RGS-His-GcpE）后，即使添加 0.5 mM IPTG 诱导（37°C 培养 15 h），番茄红素积累量与空载体对照无显著差异（P<0.05）
- 在拟南芥中，过表达 HDS 的转基因株系（clb4-3 35S::HDS 和 WT 35S::HDS）的 HDS 转录本和蛋白水平相对未转化对照显著提高，但叶绿素和类胡萝卜素水平无显著变化
- clb4-3 突变体（HDS 部分功能缺失）表现出轻微淡色表型和色素减少，过表达 HDS 可恢复至野生型。结果表明 HDS 活性上调不能增加 MEP 途径通量。
研究结论
本研究表明，在细菌和植物质体中，通过 MEP 途径增强代谢通量以满足高峰期需求并不需要增加 HDS 活性；HDS 不是 MEP 途径的限速酶，其通量控制系数较低，与 DXS、DXR 和 HDR 等限速酶不同。