Biosynthetic machinery for \mathbf{C}_{25},\mathbf{C}_{25}-diether archaeal lipids from the hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix
- 作者
- Ryo Yoshida, Tohru Yoshimura, Hisashi Hemmi
- 单位
- Department of Applied Molecular Bioscience, Graduate School of Biogeological Sciences, Nagoya University, Furo-cho, Chikusa-ku, Nagoya, Aichi 464-8601, Japan
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（2018）
- DOI
- 10.1016/j.bbrc.2018.02.028
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析超嗜热古菌Aeropyrum pernix中C25,C25-二醚古菌脂质（extended diether lipids）生物合成所涉及的酶，并实现在大肠杆菌中的异源重构。
研究策略
通过同源克隆获取A. pernix中假定的异戊烯基转移酶和还原酶基因，在大肠杆菌中表达纯化，利用放射性标记底物进行TLC酶活分析，然后逐步将多个古菌基因导入大肠杆菌构建多基因表达质粒，实现全合成。
核心内容
本研究解析了超嗜热古菌Aeropyrum pernix中C25,C25-二醚古菌脂质（extended diether lipids）生物合成的酶学机制，并在大肠杆菌中实现了异源重构。通过同源克隆获取A. pernix中推定的异戊烯基转移酶和还原酶基因，在大肠杆菌中表达纯化后，利用放射性标记底物进行TLC酶活分析。研究发现APE_0621特异性催化[14C]GFPP与G1P生成GFGP（产物Rf=0.77），而来源于Sulfolobus solfataricus的GGGP合酶无法利用GFPP，表明APE_0621为识别C25异戊烯基链的GFGP合酶；APE_0159则以GFPP和GFGP为最适底物生成DGFGP（产物Rf=0.33）。进一步将GFPP合酶（APE_1764）、GFGP合酶（APE_0621）、DGFGP合酶（APE_0159）及源自Methanosarcina acetivorans的G1P脱氢酶共同导入大肠杆菌，检测到m/z 971.9的DGFGP-甘油峰；再引入还原酶APE_1952后峰移至m/z 991.9，实现完全还原，而来源于S. acidocaldarius的GGR仅能部分还原。本研究首次鉴定了C25特异性的GFGP合酶、DGFGP合酶和香叶基法尼基还原酶，并在大肠杆菌中成功生产完全还原的C25,C25-二醚脂质（disesterterpanylglyceryl phosphoglycerol），为古菌脂质合成生物学提供了新工具。
创新点
首次鉴定了特异性识别C25异戊烯基链的GFGP合酶、DGFGP合酶和香叶基法尼基还原酶；首次在大肠杆菌中重组生产了嗜极菌特异性C25,C25-二醚脂质。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | C25,C25-二醚古菌脂质生物合成 | APE_0621 | GFGP合酶（geranylfarnesylglycerol phosphate synthase） | 催化 | 催化GFPP与G1P生成GFGP |
| Escherichia coli | C25,C25-二醚古菌脂质生物合成 | APE_0159 | DGFGP合酶（digeranylfarnesylglycerol phosphate synthase） | 催化 | 催化第二个GFPP转移到GFGP生成DGFGP |
| Escherichia coli | C25,C25-二醚古菌脂质生物合成 | APE_1952 | 香叶基法尼基还原酶（geranylfarnesyl reductase） | 催化 | 还原DGFGP中的法尼基双键生成完全饱和C25链 |
| Escherichia coli | C25,C25-二醚古菌脂质生物合成 | APE_1764 | GFPP合酶（farnesylgeranyl pyrophosphate synthase） | 催化 | 催化异戊烯基链延长生成C25前体GFPP |
| Escherichia coli | C25,C25-二醚古菌脂质生物合成 | G1P dehydrogenase（源自Methanosarcina acetivorans） | G1P脱氢酶 | 催化 | 催化磷酸二羟丙酮生成sn-甘油-1-磷酸 |
关键发现
- APE_0621催化[14C]GFPP与G1P生成GFGP（产物Rf=0.77），而S. solfataricus GGGP合酶不能利用GFPP；APE_0159以GFPP和GFGP为最适底物，产物Rf=0.33，而用GGPP/GFGP或GFPP/GGGP时产物量较低；在E. coli中表达GFPP合酶、GFGP合酶、DGFGP合酶后检测到m/z
- 9峰（DGFGP-甘油加2Na），进一步引入APE_1952后峰移至m/z
- 9（完全还原），而引入S. acidocaldarius GGR只能部分还原。
研究结论
本研究鉴定了A. pernix中C25,C25-二醚脂质生物合成的三个酶，并成功在大肠杆菌中重构了完全还原的C25,C25-二醚脂质（disesterterpanylglyceryl phosphoglycerol）的生产。