Production of a novel recombinant Drosophila melanogaster acetylcholinesterase for detection of organophosphate and carbamate insecticide residues
- 作者
- Songci Xu, Aibo Wu, Haode Chen, Yang Xie, Yuquan Xu, Lei Zhang, Jie Li, Dabing Zhang
- 单位
- Shanghai Jiao Tong University, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Pennsylvania State University Joint Center for Life Sciences, Key Laboratory of Microbial Metabolism, Ministry of Education, College of Life Science and Biotechnology; Institute of Shanghai Food and Drug Supervision
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2007）
- DOI
- 10.1016/j.bioeng.2006.12.002
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有用于农药残留检测的乙酰胆碱酯酶（AChE）存在来源有限、灵敏度低、稳定性差等缺陷，需要一种可低成本大量生产且对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂具有高灵敏度的重组AChE。
研究策略
通过RT-PCR从果蝇中克隆去除信号肽和GPI锚定序列的乙酰胆碱酯酶cDNA，构建pPIC9K/DmAChE表达载体；在毕赤酵母GS115中经甲醇诱导分泌表达，经硫酸铵沉淀纯化得到重组酶R-DmAChE，并对其酶学性质、抑制剂敏感性和实际样品检测性能进行表征。
研究路线图
核心内容
针对现有农药残留检测用乙酰胆碱酯酶来源有限、灵敏度和稳定性不足的问题，本研究通过RT-PCR克隆了去除信号肽和GPI锚定序列的果蝇乙酰胆碱酯酶cDNA，构建pPIC9K/DmAChE表达载体，在毕赤酵母GS115中经甲醇诱导实现分泌表达，并利用硫酸铵沉淀简便纯化获得重组酶R-DmAChE。结果显示，重组菌株最高表达量达180 U/mg总蛋白；该酶对敌敌畏、涕灭威和西维因的双分子速率常数较天然酶提高3至9倍，对敌敌畏和克百威的IC50分别低至9.77×10⁻⁴ μM和1.02×10⁻³ μM，灵敏度显著优于常用酶源。酶液在4°C、pH 7.6条件下储存22天仅损失25%活性，稳定性优于市售酶。在实际蔬菜加标样品中，0.01 mg/kg的敌敌畏或克百威即可引起≥80%酶活抑制，加标回收率为84%至120%，并对市场样品成功检出氧化乐果残留。该研究提供了一种低成本、高灵敏且稳定的重组乙酰胆碱酯酶制备途径，适用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速筛查。
创新点
首次在毕赤酵母中分泌表达重组果蝇乙酰胆碱酯酶；通过去除GPI锚定序列实现了酶的分泌与简便纯化；得到的R-DmAChE对多种有机磷/氨基甲酸酯农药的灵敏度显著高于常见的EeAChE、MdAChE等，且在4°C下稳定性优于市售酶。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢/醇氧化酶调控 | AOX1启动子 | — | 调控 | 甲醇诱导型强启动子，驱动DmAChE cDNA表达 |
| Pichia pastoris GS115 | 分泌表达途径 | α-factor信号肽编码序列 | — | 转运 | 引导重组乙酰胆碱酯酶分泌至细胞外培养基 |
| Pichia pastoris GS115 | 乙酰胆碱代谢 | DmAChE（去除信号肽和GPI锚定序列的截短cDNA，GenBank NM_057605） | 重组果蝇乙酰胆碱酯酶（R-DmAChE） | 催化 | 水解乙酰胆碱，为有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的靶标酶 |
| Pichia pastoris GS115 | — | GPI锚定信号序列（去除） | — | 区室化 | 删除GPI锚定序列使酶由膜结合型变为分泌型，利于下游分离纯化 |
关键发现
- 重组菌株最高表达量达180 U/mg总蛋白
- R-DmAChE对敌敌畏、涕灭威和西维因的双分子速率常数分别为4.4E6、4.8E4和5.9E5 M⁻¹min⁻¹，较天然酶提高3-9倍
- 对敌敌畏和克百威的IC50分别低至9.77E-04 μM和1.02E-03 μM，均低于常用AChE
- 酶液在4°C、pH 7.6储存22天后仅损失25%活性
- 蔬菜加标样品中0.01 mg/kg敌敌畏或克百威即可引起≥80%酶活抑制，R.S.D.为0-13.7%，加标回收率84-120%
- 对市场12个蔬菜样品的检测发现2个样品含氧化乐果（0.76和0.54 mg/kg）。
研究结论
毕赤酵母表达的重组果蝇乙酰胆碱酯酶（R-DmAChE）兼具高灵敏度、高稳定性和低成本制备优势，适用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速筛查，可满足中国国家标准检测需求。