Farnesol-mediated shift in the metabolic origin of prenyl groups used for protein prenylation in plants
- 作者
- Alexandre Huchelmann, Mathieu Semir Brahim, Esther Gerber, Denis Tritsch, Thomas J. Bach, Andreha Hemmerlin
- 单位
- CNRS, Institut de biologie moleculaire des plantes conventionnee avec l'Unistra, F-67084 Strasbourg, France; CNRS/Unistra, Institut Le Bel, 4 rue Blaise Pascal, F-67081 Strasbourg, France
- 杂志
- Biochimie（2017）
- DOI
- 10.1016/j.biochi.2016.04.021
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物细胞如何调控质体MEP途径与胞质MVA途径之间异戊烯基二磷酸的交换？法尼醇为何能部分恢复MEP途径抑制导致的蛋白质异戊二烯化缺失？
研究策略
利用烟草BY-2细胞表达可异戊烯化的GFP-CVIL报告蛋白，结合MEP/MVA途径特异性抑制剂和化学互补试验（不同链长异戊烯醇），通过荧光显微镜分析蛋白膜定位；同时利用工程大肠杆菌、荧光标记法尼醇类似物及生化酶活分析验证法尼醇对MEP途径的抑制和对MVA途径的激活作用。
核心内容
该研究以烟草BY-2细胞表达可异戊烯化的GFP-CVIL报告蛋白为体系，结合MEP/MVA途径特异性抑制剂和化学互补试验，探究法尼醇在植物蛋白质异戊烯化中的作用机制。结果表明，法尼醇（C15）能在MEP途径被50 μM fosmidomycin抑制时恢复GFP-CVIL的膜定位，20 μM法尼醇使55%细胞恢复定位，但该恢复依赖MVA途径功能完整——加入5 μM mevinolin阻断MVA途径后恢复消失并出现30%核定位；香叶基香叶醇（C20）的恢复作用则不受MVA状态影响。在大肠杆菌工程菌中，4 mM法尼醇显著抑制依赖MEP途径的生长，但不影响依赖MVA途径的生长，且1 mM法尼醇在15 min内不抑制木酮糖激酶活性。荧光标记实验显示法尼醇类似物与质体共定位，并能在30 μM浓度下1-6 h内改变质体形态。这些结果揭示法尼醇并非作为直接代谢前体，而是通过抑制质体MEP途径并激活胞质MVA途径的信号作用，使蛋白质异戊烯化的异戊烯基前体来源从MEP转向MVA，可能成为植物两条异戊二烯途径交叉对话的中央调节因子。
创新点
首次揭示法尼醇并非作为直接代谢前体补充蛋白质异戊烯化，而是通过信号作用使异戊烯基的代谢来源从质体MEP途径向胞质MVA途径转换；提出法尼醇是植物两条异戊二烯生物合成途径交叉对话的潜在中央调节因子。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草BY-2细胞 | 蛋白质异戊烯化 | — | GFP-CVIL | 区室化 | C端含geranylgeranylation CaX motif (CVIL) 的嵌合蛋白，异戊烯化后定位于质膜，否则进入细胞核，用于体内检测异戊烯化及前体代谢来源 |
| 烟草BY-2细胞 | MVA通路 | HMGR (HMG1/HMG2) | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 法尼醇通过转录激活应力形式HMGR2增强MVA途径，在MEP抑制时提供异戊烯基前体 |
| 大肠杆菌dxs::KAN突变株（表达Lactobacillus plantarum MVA操纵子） | MEP通路 | dxs | — | 催化 | dxs基因敲除使菌株必须依赖外源DX（MEP）或MVA生长，用于测试法尼醇对MEP途径的特异性抑制 |
| 大肠杆菌 | MEP通路 | dxk (xylulokinase) | D-木酮糖激酶 (EcXK) | 催化 | 催化DX磷酸化为DXP；法尼醇不抑制其活性，排除法尼醇作用于该步骤 |
| 烟草BY-2细胞 | 蛋白质异戊烯化 | — | protein geranylgeranyltransferase I (GGTase-I) | 催化 | 负责催化GFP-CVIL的香叶基香叶基化修饰，以GGPP为底物 |
| 烟草BY-2细胞 | — | — | PT5-RFP | 区室化 | 质体基质标记蛋白，用于观察法尼醇与质体互作及质体形态变化 |
关键发现
- 法尼醇（C15）可在MEP途径被抑制时恢复烟草BY-2细胞中GFP-CVIL的异戊烯化，但仅在MVA途径功能完整时有效
- 用50 μM fosmidomycin阻断MEP途径时，20 μM法尼醇处理使55%细胞恢复膜定位，而加入5 μM mevinolin阻断MVA途径后该恢复消失，出现30%核定位
- 香叶基香叶醇（C20）则不受MVA途径状态影响。法尼醇（4 mM）显著抑制依赖MEP途径生长的大肠杆菌工程菌（dxs::KAN+植物乳杆菌MVA操纵子，以750 μM DX为底物）的菌落和液体培养生长，但对依赖MVA途径（以MVA为底物）的生长无影响
- 1 mM法尼醇在15 min内不抑制大肠杆菌木酮糖激酶（EcXK）活性。荧光法尼醇类似物（NBD-geraniol）与质体共定位，且30 μM法尼醇处理1-6 h改变质体形态
- 100 μM法尼醇处理烟草叶盘72 h仅使色素含量轻微下降。
研究结论
法尼醇（或其代谢物）通过抑制质体MEP途径并激活胞质MVA途径，使蛋白质异戊烯化所用的异戊烯基前体来源从MEP转向MVA，从而成为调控植物异戊二烯生物合成途径间交叉对话的潜在中央分子。