Production of trans-2-methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienoic acid by Pseudomonas rhodesiae CIP 107491
- 作者
- Denis Linares, Daniela Martinez, Pierre Fontanille, Christian Larroche
- 单位
- Laboratoire de Génie Chimique et Biochimique, Polytech Clermont-Ferrand, Université Blaise Pascal, BP 206, F-63174 Aubière Cedex, France
- 杂志
- Bioresource Technology（2007）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2007.07.029
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用Pseudomonas rhodesiae CIP 107491的α-蒎烯降解途径生产trans-2-甲基-5-异丙基己-2,5-二烯酸（novalic acid），解决底物毒性、细胞通透化及辅因子再生导致酸积累困难的问题。
研究策略
采用两阶段策略：先在氧限制条件下以α-蒎烯为唯一碳源培养获得高活性生物量，再在双相（水/十六烷）系统中用浓缩静息细胞进行生物转化，以α-蒎烯氧化物为前体生成novalic酸，并考察前体种类、浓度、通气等条件。
研究路线图
核心内容
本研究利用Pseudomonas rhodesiae CIP 107491的α-蒎烯降解途径，首次实现了trans-2-甲基-5-异丙基己-2,5-二烯酸（novalic acid）的微生物生产。研究采用两阶段策略：先在氧限制条件下以α-蒎烯为唯一碳源培养获得高活性生物量，再在双相水/十六烷系统中以α-蒎烯氧化物为前体进行生物转化。以α-蒎烯为唯一碳源培养时获得最佳活性，初始速率达1.6 g/L·h，最大酸浓度15.1 g/L，产率53%。在双相系统中以α-蒎烯氧化物为前体反应12小时，获得约12 g/L酸（其中约80%为novalic acid），平均产率接近50%。研究还发现异onovalal经辅因子依赖的酶促异构化生成novalal，且α-蒎烯氧化物和异onovalal对细胞具有毒性和通透化效应，可导致呼吸链失活和酸合成停止。结果表明，完整细胞对辅因子再生和维持转化活性至关重要，该策略为利用微生物降解途径生产高价值萜类酸提供了可行方案。
创新点
['首次实现并定量表征novalic acid的微生物积累', '发现异onovalal向novalal的辅因子依赖性酶促异构化反应', '揭示α-蒎烯氧化物和异onovalal对菌株的毒性和通透化效应及其对呼吸链的失活作用', '证明氧限制培养对后续生物转化活性的必要性']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 | α-蒎烯降解途径 | — | α-蒎烯单加氧酶 | 催化 | 将α-蒎烯氧化为α-蒎烯氧化物，NADH依赖 |
| Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 | α-蒎烯降解途径 | — | α-蒎烯氧化物裂解酶 | 催化 | 将α-蒎烯氧化物脱环生成异onovalal，无需辅因子 |
| Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 | α-蒎烯降解途径 | — | NAD+依赖的脱氢酶 | 催化 | 将醛（异onovalal/novalal）氧化为相应酸 |
| Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 | α-蒎烯降解途径 | — | 推测的异构酶（辅因子依赖） | 催化 | 催化异onovalal异构化为novalal，推测为辅因子依赖 |
关键发现
- 以α-蒎烯为唯一碳源培养得到的生物量活性最高：初始速率Vi=1.6 g/L·h，最大酸浓度Cmax=15.1 g/L，产率Y=53%（表2）
- 在生物反应器中，氧限制培养可获得与摇瓶相当的活性（Cmax约13-14 g/L）。以α-蒎烯氧化物为前体，在双相系统中反应12小时，获得约12 g/L酸（其中约80%为novalic acid），平均产率接近50%。异onovalal毒性强：3.2 g/L时10小时致细胞通透化，32.5 g/L时2小时，38 g/L时立即通透化。α-蒎烯氧化物初始浓度≤30 g/L时产率约52%，更高时下降。
研究结论
本研究证明了利用P. rhodesiae CIP 107491活细胞生产novalic酸的可行性。生物量需在α-蒎烯为唯一碳源并经历氧限制下培养；生物转化需在有氧条件下进行，且需完整细胞以再生辅因子。发现异onovalal经辅因子依赖的酶促异构化生成novalal，两种醛可被氧化为相应酸。底物（α-蒎烯氧化物和异onovalal）对细胞有通透化作用，导致呼吸链失活和酸合成停止。最终在双相系统中以α-蒎烯氧化物为前体，获得约12 g/L酸（80% novalic acid），平均产率约50%。