Functional Analysis of the Brassica napus L. Phytoene Synthase (PSY) Gene Family
- 作者
- Ada López-Emparán, Daniela Quezada-Martinez, Matías Zúñiga-Bustos, Victor Cifuentes, Federico Iñiguez-Luy, María Laura Federico
- 单位
- Genomics and Bioinformatics Unit, Agriaquaculture Nutritional Genomic Center, CGNA, Temuco, La Araucania, Chile; Instituto de Biologia Vegetal y Biotecnologia, Universidad de Talca, Talca, Maule, Chile; Depto. Cs. Ecológicas, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago, Región Metropolitana, Chile
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0114878
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
确定甘蓝型油菜中六个PSY基因是否均编码功能性八氢番茄红素合酶，并评估其作为油料作物类胡萝卜素代谢工程转基因候选基因的潜力。
研究策略
克隆六个B. napus PSY基因的完整编码序列，进行序列与进化分析；预测三维结构；利用大肠杆菌异源互补系统逐一验证酶活性；通过RT-PCR分析种子发育不同阶段的表达模式。
核心内容
甘蓝型油菜基因组中含有六个八氢番茄红素合酶（PSY）基因，但其是否均编码有功能的酶此前缺乏系统验证。该研究克隆了六个基因的完整编码序列，通过序列比对、进化分析、三维结构预测和大肠杆菌异源互补实验逐一验证酶活性，并结合种子发育各阶段的RT-PCR表达谱筛选代谢工程候选基因。结果显示，六个PSY蛋白序列一致性为87.3%至98.8%，各同源基因对的Ka/Ks值均低于0.28，表明受到强烈的纯化选择。所有六个PSY酶均能在缺失crtB的大肠杆菌类胡萝卜素合成菌株中恢复β-胡萝卜素合成，证明它们都是功能性八氢番茄红素合酶，其中BnaA.PSY.d产生的β-胡萝卜素积累量最高。表达分析显示，除BnaC.PSY.e外，其余基因在种子发育20至60天期间均有可检测的表达。综合酶活性与表达水平，BnaA.PSY.d被确定为油料作物类胡萝卜素代谢工程的首选转基因候选，为后续改造油菜种子类胡萝卜素含量提供了明确靶点。
创新点
首次实验证明B. napus六个PSY基因均编码有活性的八氢番茄红素合酶；结合结构预测与功能互补筛选出最适代谢工程候选基因BnaA.PSY.d。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21-Gold | 类胡萝卜素生物合成途径 | BnaC.PSY.a | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | 异源互补实验证实具有八氢番茄红素合酶活性，可恢复β-胡萝卜素合成。 |
| Escherichia coli BL21-Gold | 类胡萝卜素生物合成途径 | BnaA.PSY.b | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | 异源互补实验证实具有八氢番茄红素合酶活性。 |
| Escherichia coli BL21-Gold | 类胡萝卜素生物合成途径 | BnaA.PSY.c | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | 异源互补实验证实具有八氢番茄红素合酶活性。 |
| Escherichia coli BL21-Gold | 类胡萝卜素生物合成途径 | BnaA.PSY.d | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | 异源互补实验中β-胡萝卜素产量最高的B. napus PSY基因。 |
| Escherichia coli BL21-Gold | 类胡萝卜素生物合成途径 | BnaC.PSY.e | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | 异源互补实验证实具有八氢番茄红素合酶活性；种子发育期间表达量最低。 |
| Escherichia coli BL21-Gold | 类胡萝卜素生物合成途径 | BnaC.PSY.f | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | 异源互补实验证实具有八氢番茄红素合酶活性。 |
| Brassica napus cv. Westar | 类胡萝卜素生物合成途径 | BnaC.PSY.a, BnaA.PSY.b, BnaA.PSY.c, BnaA.PSY.d, BnaC.PSY.e, BnaC.PSY.f | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | RT-PCR分析种子发育20、30、45、60 dpa时各PSY基因的表达模式。 |
关键发现
- 六个B. napus PSY蛋白序列一致性为87.3%-98.8%，去除转运肽后为91.6%-99.4%
- 所有同源基因对Ka/Ks值均低于0.28，表明受纯化选择
- 六个PSY酶均可在大肠杆菌中互补缺失crtB的类胡萝卜素合成菌株并产生β-胡萝卜素，其中BnaA.PSY.d产生的β-胡萝卜素积累量最高
- 种子发育20、30、45、60 dpa时，BnaC.PSY.a/BnaA.PSY.b和BnaA.PSY.d/BnaC.PSY.f均检测到表达，BnaC.PSY.e表达量最低。
研究结论
六个B. napus PSY基因均编码功能性酶，其中BnaA.PSY.d因在种子中表达较高且酶活性最强，可作为油籽作物类胡萝卜素代谢工程的首选转基因候选。