Optimized enzymatic preparation of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate
- 作者
- Yue-Fei Zhou, Zhe Cui, Heng Li, Jie Tian, Wen-Yun Gao
- 单位
- College of Life Sciences/National Engineering Research Center for Miniaturized Detection Systems, Northwest University, 229 North Taibai Road, Xi'an, Shaanxi 710069, PR China
- 杂志
- Bioorganic Chemistry（2010）
- DOI
- 10.1016/j.bioorg.2010.01.003
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有酶法合成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)的产率低、纯化耗时长，难以满足对DXR抑制剂筛选及同位素标记DXP的需求。
研究策略
利用Rhodobacter capsulatus的重组DXP合酶(DXS)与商业磷酸丙糖异构酶(TIM)偶联，以二羟丙酮3-磷酸(DHAP)和丙酮酸为底物，通过单锅酶促反应合成DXP，并优化pH、酶量、底物比、温度和时间等反应条件，同时建立新的离子交换纯化工艺。
核心内容
本研究建立了一种高效酶法合成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP）的工艺。作者利用Rhodobacter capsulatus来源的重组DXP合酶（DXS）与商业磷酸丙糖异构酶（TIM）偶联，以二羟丙酮3-磷酸（DHAP）和丙酮酸为底物进行单锅酶促反应，并对pH、酶量、底物比、温度和时间等条件进行了系统优化。最优条件为pH 7.5–8.0、TIM 0.2 μg/μL、DXS 0.8 μg/μL、丙酮酸/DHAP摩尔比2.0、37°C反应过夜，可使DXP浓度达到450 mM。以100 mg Li2-DHAP和121.5 mg丙酮酸钠为底物时，获得96 mg DXP，产率高达81.5%，纯度大于95%。在纯化方面，作者建立了基于DEAE Sephadex A-25的温和离子交换方法，将纯化时间缩短至约200分钟，整个流程不超过10小时，避免了强酸强盐对产物的破坏。该方法简单快速、产率高、纯度高，尤其适合大量制备及同位素标记DXP，为DXR抑制剂筛选和MEP途径机制研究提供了便捷的工具。
创新点
首次使用R. capsulatus DXS进行较大规模DXP合成并系统优化反应条件；建立基于DEAE Sephadex A-25的温和离子交换纯化方法，显著缩短纯化时间（约200分钟），避免强酸强盐对产物的破坏。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP途径 | dxs | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) | 催化 | 重组Rhodobacter capsulatus DXS在大肠杆菌中过表达，催化丙酮酸与D-甘油醛-3-磷酸缩合生成DXP |
| — | 糖酵解/磷酸丙糖异构 | — | triosephosphate isomerase (TIM) | 催化 | 商业来源，催化DHAP异构化为D-GAP，为DXS提供底物 |
关键发现
- 优化条件下DXP浓度可达450 mM；以100 mg Li2-DHAP(0.55 mmol)和121.5 mg丙酮酸钠(1.1 mmol)为底物，经0.2 mg TIM和0.8 mg DXS在37°C反应过夜，获得96 mg DXP，产率81.5%，纯度>95%；最优反应条件为pH
- 5-8.0、TIM
- 2 μg/μL、DXS
- 8 μg/μL、丙酮酸/DHAP摩尔比2.0、反应温度37°C；整个纯化流程不超过10小时。
研究结论
该酶法制备DXP的方法简单快速、产率高、产物纯度高，适用于大量制备及同位素标记DXP，为DXR抑制剂筛选和MEP途径机制研究提供了便利。