Development of a mutant of Trichoderma citrinoviride for enhanced production of cellulases
- 作者
- Mahesh Chandra, Alok Kalra, Neelam S. Sangwan, Shailendra S. Gaurav, Mahender P. Darokar, Rajinder S. Sangwan
- 单位
- Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow-226015, UP, India; Department of Biotechnology, Chaudhary Charan Singh University, Meerut-250004, UP, India
- 杂志
- Bioresource Technology（2008）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2008.09.011
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型 Trichoderma citrinoviride 纤维素酶产量低，且受葡萄糖等分解代谢物抑制，特别是 β-葡萄糖苷酶不足导致纤维二糖积累并抑制酶合成，难以满足工业生物转化需求。
研究策略
通过多次交替使用化学诱变剂 EMS 和溴化乙锭处理 T. citrinoviride 孢子，结合平板筛选和摇瓶复筛，获得高产且对分解代谢物抑制不敏感的突变株 EB-104，并进一步分析其酶活、耐糖性、乙醇激活作用、糖化效率及 DNA 指纹。
研究路线图
核心内容
针对野生型Trichoderma citrinoviride纤维素酶产量低且受葡萄糖分解代谢物抑制、β-葡萄糖苷酶不足导致纤维二糖积累的问题，该研究采用EMS与溴化乙锭交替多次处理孢子，结合平板筛选与摇瓶复筛，从超过7500个突变体中选育出突变株EB-104。与亲本相比，EB-104的FPase、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和纤维二糖酶活性分别达0.63、3.12、8.22和1.94 IU/ml，较亲本提高2.14、2.10、4.09和1.73倍；在葡萄糖浓度达20 mM时酶的产生不受抑制，而亲本在15 mM即被抑制。体外实验还发现，20 mM和30 mM乙醇分别使β-葡萄糖苷酶活性提高1.5倍和2.6倍，20 mM乙醇使内切葡聚糖酶活性提高2.0倍。突变株对纤维素的糖化率为57%，高于亲本的41%，DNA指纹检测到差异条带。结果表明化学诱变可同时提升纤维素酶产量、解除代谢物抑制并增强酶系对葡萄糖和乙醇的耐受性，该突变株在纤维素糖化及生物转化产乙醇方面具有应用潜力。
创新点
获得一株产极高 β-葡萄糖苷酶（8.22 IU/ml）的突变株，对葡萄糖（20 mM）不敏感；体外实验发现乙醇在低浓度下反而能激活内切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶活性；DNA 指纹检测到突变株特有的差异条带。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Trichoderma citrinoviride | 纤维素降解 | — | FPase（滤纸酶） | 催化 | 总纤维素酶活性，突变株 EB-104 达 0.63 IU/ml，为亲本的 2.14 倍 |
| Trichoderma citrinoviride | 纤维素降解 | — | 内切葡聚糖酶（endoglucanase） | 催化 | 突变株活性 3.12 IU/ml，为亲本的 2.10 倍；20 mM 乙醇可使其活性提高 2.0 倍 |
| Trichoderma citrinoviride | 纤维素降解 | — | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 突变株活性 8.22 IU/ml，为亲本的 4.09 倍；20 mM 和 30 mM 乙醇分别使其活性提高 1.5 倍和 2.6 倍 |
| Trichoderma citrinoviride | 纤维素降解 | — | 纤维二糖酶（cellobiase） | 催化 | 突变株活性 1.94 IU/ml，为亲本的 1.73 倍 |
关键发现
- 突变株 EB-104 的 FPase、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和纤维二糖酶活性分别为
- 63、3.12、8.22 和
- 94 IU/ml，较亲本（0.29、1.49、2.01、1.12 IU/ml）分别提高
- 14、2.10、4.09 和
- 73 倍；葡萄糖浓度达 20 mM 时不抑制突变株的酶产生，而亲本在 15 mM 时即被抑制；体外 45 mM 葡萄糖对突变株酶活性无明显抑制；20 mM 和 30 mM 乙醇分别使 β-葡萄糖苷酶活性提高
- 5 倍和
- 6 倍，20 mM 乙醇使内切葡聚糖酶活性提高
- 0 倍；突变株对纤维素的糖化率为 57%，亲本为 41%；共筛选超过 7500 个突变体，最终选育出 EB-104。
研究结论
通过化学诱变可显著提高 T. citrinoviride 的纤维素酶产量和 β-葡萄糖苷酶水平，同时降低对葡萄糖分解代谢物抑制的敏感性，且酶系对葡萄糖和乙醇的耐受性增强，该突变株在纤维素生物转化生产乙醇等领域具有应用潜力。