Construction and co-expression of a polycistronic plasmid encoding carbonyl reductase and glucose dehydrogenase for production of ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxytbutanoate
- 作者
- Qi Ye, Hou Cao, Ming Yan, Fei Cao, Yueyuan Zhang, Ximu Li, Lin Xu, Yong Chen, Jian Xiong, Pingkai Ouyang, Hanjie Ying
- 单位
- State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing 210009, PR China; College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, PR China; National Engineering Technique Research Center for Biotechnology, Nanjing 211816, PR China
- 杂志
- Bioresource Technology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2010.03.099
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解决生物催化还原COBE生产(S)-CHBE过程中辅因子NADPH成本高的问题，通过共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶实现辅因子原位再生，并优化多顺反子质粒提高双酶表达水平。
研究策略
构建多顺反子质粒共表达来自Pichia stipitis的羰基还原酶(PsCR)和来自Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶(BmGDH)，通过改变基因顺序、SD序列和SD与起始密码子之间的间隔(AS)来优化双酶表达量；并采用水/辛酸乙酯双相系统以减轻底物和产物抑制。
研究路线图
核心内容
该研究构建多顺反子质粒，在Escherichia coli Rosetta(DE3)中共表达来自Pichia stipitis的羰基还原酶(PsCR)和Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶(BmGDH)，以实现辅因子NADPH原位再生，降低生物催化还原COBE生产(S)-CHBE的成本。通过系统优化基因顺序、SD序列及SD与起始密码子间隔(AS)，确定最优组合pET-B-SD2-AS1-P，使PsCR活性达16 U/mg、BmGDH活性达11 U/mg。在水/辛酸乙酯双相系统中，底物COBE初始200 mM，24 h后有机相(S)-CHBE达1260 mM，摩尔产率90%，e.e.>99%，总周转数(TTN)达12,600，较水相系统提高逾10倍。该双相策略有效缓解了底物与产物的抑制效应，显著提升了产物的终浓度和酶的总周转效率，为工业化生产手性醇类化合物提供了一条经济可行的辅因子再生与产物分离一体化路径。
创新点
系统研究了多顺反子质粒中基因顺序、SD序列和AS距离对共表达水平的影响；确定最优SD序列5-TAAGGAGG-3和AS距离8个核苷酸；在水/辛酸乙酯双相系统中实现了(S)-CHBE的高浓度生产，TTN达12,600，较水相系统提高10倍以上。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 不对称还原COBE合成(S)-CHBE途径 | PscR | PsCR | 催化 | 催化4-氯-3-氧代丁酸乙酯(COBE)不对称还原为乙基(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯[(S)-CHBE]，需要NADPH |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 辅因子再生途径（葡萄糖氧化） | BmGDH | BmGDH | 催化 | 催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时将NADP+还原为NADPH，用于辅因子再生 |
关键发现
- 从Bacillus megaterium中克隆了BmGDH基因(783 bp，编码261个氨基酸，分子量28.1 kDa)，与B. megaterium IAM1030的GDH同源性98%。单独表达BmGDH活性为12 U/mg。通过优化，最优质粒pET-B-SD2-AS1-P在E. coli Rosetta(DE3)中共表达PsCR(16 U/mg，以COBE为底物)和BmGDH(11 U/mg，以葡萄糖为底物)。酶稳定性方面，在40 mM COBE下PsCR和BmGDH活性损失约80%
- 在100 mM CHBE下PsCR活性损失70%，BmGDH完全失活。在水相系统中，重组细胞产生133 mM (S)-CHBE，摩尔产率95%，e.e.>99%，TTN为1330。在水/辛酸乙酯双相系统中，初始COBE 200 mM，0.5 h后产生>150 mM CHBE，24 h后有机相中(S)-CHBE达1260 mM，摩尔产率90%，e.e.>99%，TTN为12,600，比水相系统高10倍以上。
研究结论
通过优化多顺反子质粒的基因顺序、SD序列和AS距离，实现了PsCR和BmGDH的高效共表达。最优质粒pET-B-SD2-AS1-P使E. coli Rosetta(DE3)同时具有16 U/mg的PsCR活性(COBE为底物)和11 U/mg的BmGDH活性(葡萄糖为底物)。在双相系统中，(S)-CHBE产量达1260 mM，TTN 12,600，较水相系统提高10倍以上，且e.e.>99%，表明该工艺具有经济可行性。