Expression, purification and use of the soluble domain of Lactobacillus paracasei β-fructosidase to optimise production of bioethanol from grass fructans
- 作者
- C.M. Martel, A.G.S. Warrilow, C.J. Jackson, J.G.L. Mullins, R.C. Togawa, J.E. Parker, M.S. Morris, I.S. Donnison, D.E. Kelly, S.L. Kelly
- 单位
- Institute of Life Science and School of Medicine, Swansea University, Swansea SA2 8PP, Wales, UK; Institute of Biological, Environmental & Rural Sciences, Aberystwyth University, Gogerddan, Aberystwyth SY23 3EB, Wales, UK; Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Laboratório de Bioinformática, Parque Estação Biológica – Final W5 norte, Caixa Postal 02372, Brasília, DF 70770-900, Brazil
- 杂志
- Bioresource Technology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2010.01.084
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
植物果聚糖（尤其是黑麦草来源的果聚糖）难以被酿酒酵母直接利用，导致生物乙醇产量受限；需要一种能高效水解果聚糖释放可发酵果糖的酶，以优化草汁原料生产生物乙醇。
研究策略
从副干酪乳杆菌中克隆并截短表达β-果糖苷酶（fosE）的可溶结构域（fosEp），在大肠杆菌中过表达和纯化，表征其生化特性；用fosEp预处理草汁（GJ），并对比商业外切/内切菊粉酶，随后用啤酒酵母进行发酵生产乙醇。
研究路线图
核心内容
该研究针对黑麦草来源果聚糖难以被酿酒酵母直接利用的问题，从副干酪乳杆菌中克隆并截短表达了β-果糖苷酶的可溶结构域fosEp，在大肠杆菌中实现过表达和纯化，并系统表征了其生化特性。结果发现，fosEp具有广谱底物特异性，兼具外切菊粉酶、外切果聚糖酶和转化酶活性，对细菌左聚糖的亲和力最高（Km为0.5 mM），最适pH为5–5.5，热稳定性范围为10–50°C。随后，利用fosEp预处理草汁再进行酵母发酵，可发酵果糖浓度达到36.8 mg/ml，比未处理草汁提高了72.2%；乙醇产量达到36.5 mg/ml，较未处理组的28.2 mg/ml提高了25.9%，且显著优于商业外切菊粉酶（提高13.8%）和内切菊粉酶（无促进作用）。该研究表明fosEp能高效水解草汁中的多聚果糖，增加可发酵底物供给，为利用草汁原料生产生物乙醇提供了具有工业应用潜力的酶制剂方案。
创新点
首次报道了副干酪乳杆菌β-果糖苷酶可溶结构域（fosEp）的表达、纯化及应用；该酶具有广谱底物特异性（同时具有外切菊粉酶、外切果聚糖酶和转化酶活性），对细菌左聚糖亲和力最高；证明fosEp预处理草汁能显著提高乙醇产量，且优于商业菊粉酶。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 重组蛋白表达 | fosE（截短） | fosEp（截短的β-果糖苷酶） | 催化 | 去除N端分泌信号肽和C端肽聚糖结合域，带多聚组氨酸标签，过表达并纯化 |
| Saccharomyces cerevisiae（啤酒酵母Turbo酵母） | 生物乙醇发酵 | — | — | 催化 | 商业酿酒酵母菌株，用于草汁发酵生产乙醇 |
| Lactobacillus paracasei | 果聚糖降解 | fosE | β-果糖苷酶 | 催化 | 来源菌株，编码细胞壁锚定的139 kDa β-果糖苷酶，本文截短表达其可溶核心域 |
| — | 果聚糖水解 | — | 外切菊粉酶（Exo-I，来自黑曲霉） | 催化 | 商业酶，用于草汁预处理对照 |
| — | 果聚糖水解 | — | 内切菊粉酶（Endo-I，来自黑曲霉） | 催化 | 商业酶，用于草汁预处理对照，单独使用时未能提高可发酵果糖 |
| — | 果聚糖水解 | — | 内切菊粉酶和外切菊粉酶混合物（Exo/Endo-I） | 催化 | 商业酶组合，用于草汁预处理对照 |
关键发现
- fosEp在大肠杆菌中表达量为22.5 nmol/L，纯化后表观分子量100 kDa
- 热稳定性10-50°C，最适pH 5-5.5
- 对细菌左聚糖、nystose、菊苣菊粉、1-蔗果三糖和蔗糖的Km分别为0.5、15、15.6、49和398 mM
- fosEp预处理草汁使可发酵果糖浓度达36.8 mg/ml，比未处理草汁高72.2%（>15 mg/ml）
- 乙醇产量在GJ+fosEp条件下为36.5 mg/ml，比未处理GJ（28.2 mg/ml）高25.9%（约8.3 mg/ml，P<0.05）
- 商业外切菊粉酶处理使乙醇产量提高13.8%，商业内切菊粉酶处理未提高果糖浓度且乙醇产量下降。
研究结论
fosEp是一种具有广谱底物特异性的新型β-果糖苷酶，能有效水解草汁中的多聚果糖，增加发酵底物中果糖的可利用性，显著提高黑麦草汁生产生物乙醇的产率，具有工业应用潜力。