Biosynthesis of (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate ethyl using Escherichia coli co-expressing a novel NADH-dependent carbonyl reductase and a glucose dehydrogenase
- 作者
- Qi Ye, Hou Cao, Lan Mi, Ming Yan, Yan Wang, Qinting He, Jian Li, Lin Xu, Yong Chen, Jian Xiong, Pingkai Ouyang, Hanjie Ying
- 单位
- State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing 210009, PR China; College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, PR China; National Engineering Technique Research Center for Biotechnology, Nanjing 211816, PR China
- 杂志
- Bioresource Technology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2010.06.098
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
高效合成手性中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，需要开发具有高活性、NADH依赖的羰基还原酶，并实现辅酶再生以降低成本。
研究策略
从Pichia stipitis中克隆新型NADH依赖羰基还原酶基因PsCR II，在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达；构建多顺反子质粒pET-BP II共表达PsCR II与Bacillus megaterium来源的葡萄糖脱氢酶BmGDH，在水/乙酸丁酯两相系统中进行COBE的不对称还原。
研究路线图
核心内容
该研究从Pichia stipitis中克隆了一个新型NADH依赖型羰基还原酶基因PsCR II，并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中实现表达。该基因长855 bp，编码285个氨基酸，重组酶以COBE为底物时活性达15 U/mg蛋白，约为已报道NADH依赖还原酶的3倍，而改用NADPH时活性仅1.7 U/mg，显示出严格的NADH偏好性。研究者进一步构建多顺反子质粒共表达PsCR II与来自Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶BmGDH，利用葡萄糖氧化实现NADH原位再生。在含609 mM COBE和1.5 M葡萄糖的水/乙酸丁酯两相体系中，30°C反应24小时，0.5小时即生成117 mM产物，最终获得554 mM (S)-CHBE，摩尔产率达91%，光学纯度大于99% e.e.，底物完全转化。该工作证明共表达策略与两相反应系统能有效解决辅酶再生和产物抑制问题，为该手性砌块的工业化生产提供了高活性酶源和可行工艺路线。
创新点
首次报道了来自Pichia stipitis的NADH依赖型羰基还原酶PsCR II，其酶活性达15 U/mg，为已报道的NADH依赖还原酶中最高；通过共表达GDH实现NADH再生，并采用两相反应体系，提高了产物浓度与产率。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta (DE3) | COBE到(S)-CHBE的不对称还原 | PsCR II | 羰基还原酶 (PsCR II) | 催化 | 新型NADH依赖还原酶，开放阅读框855 bp，酶活15 U/mg |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) | 辅酶再生（葡萄糖氧化） | BmGDH | 葡萄糖脱氢酶 (BmGDH) | 催化 | 来自Bacillus megaterium，氧化葡萄糖再生NADH，支持PsCR II反应 |
关键发现
- PsCR II基因长855 bp，编码285个氨基酸
- 以COBE为底物、NADH为辅因子时，重组PsCR II酶活为15 U/mg蛋白，约为已知NADH依赖还原酶E. coli HB101/pSE-KaCR的3倍
- 以NADPH代替NADH时活性仅1.7 U/mg。共表达PsCR II和BmGDH的E. coli Rosetta(DE3)/pET-BP II显示10 U/mg（COBE还原）和11 U/mg（葡萄糖氧化）活性。在100 ml反应体系中（含609 mM COBE、1.5 M葡萄糖、0.1 mM NAD+等），水/乙酸丁酯两相系统30°C反应24 h，0.5 h即生成117 mM CHBE，24 h获得554 mM CHBE，摩尔产率91%，(S)-异构体光学纯度>99% e.e.，COBE完全转化。
研究结论
成功从Pichia stipitis中克隆并表达了新型NADH依赖羰基还原酶PsCR II，其活性超过已知NADH依赖型还原酶；通过与大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶共表达及两相反应系统，COBE可高效转化为光学纯(S)-CHBE，摩尔产率91%，光学纯度大于99% e.e.，为(S)-CHBE的工业化生产提供了新途径。