Atypical ethanol production by carbon catabolite derepressed lactobacilli
- 作者
- Jae-Han Kim, David E. Block, Sharon P. Shoemaker, David A. Mills
- 单位
- Department of Viticulture and Enology, University of California, Davis; Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Davis; California Institute of Food and Agricultural Research, University of California, Davis
- 杂志
- Bioresource Technology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2010.06.087
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素生物质转化为生物基化学品过程中，微生物对混合糖的序贯利用（碳分解代谢物阻遏）导致戊糖利用率低、发酵过程设计和效率低下，且传统乳酸菌产乙醇能力弱。
研究策略
以2-脱氧葡萄糖为选择压力，从戊糖乳杆菌JH5中筛选获得碳分解代谢物阻遏缺失（CCR-）突变株JH5XP5，并利用其同时利用葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的特性，构建同步糖化与混合糖发酵（SSMSF）集成工艺处理酸预处理稻草。
核心内容
研究以2-脱氧葡萄糖为选择压力，从戊糖乳杆菌JH5中筛选获得碳分解代谢物阻遏缺失突变株JH5XP5。该突变株可在24小时内同时消耗10 g/L葡萄糖和10 g/L木糖，比生长速率0.26 h⁻¹，彻底解除了传统乳酸菌对戊糖的序贯利用限制。值得注意的是，该菌株在葡萄糖、半乳糖和麦芽糖为碳源时表现出非典型产乙醇表型，乙醇摩尔产率分别达1.41、1.36和2.60 mmol/mmol，为乳酸产率的2.0–2.5倍，且几乎不产乙酸。在补料分批发酵中，30 g/L葡萄糖、10 g/L木糖和10 g/L阿拉伯糖于16小时内同步耗尽，最终生成乙醇13 g/L。将该菌株用于酸预处理稻草的同步糖化与混合糖发酵集成工艺，发酵21小时完成，乳糖、乙酸、乙醇产量分别为25.3、14.3和3.7 g/L，且无需额外酶解即可结束发酵。该突变株为木质纤维素生物炼制提供了能同步利用混合糖并高效产乙醇的菌株资源，同时显著减少纤维素酶用量并缩短操作周期。
创新点
（1）获得表型稳定的CCR-突变株L. pentosus JH5XP5，可同时消耗葡萄糖和戊糖；（2）发现该菌株在葡萄糖、半乳糖和麦芽糖上生长时产生乙醇的摩尔产率是乳酸的2.0-2.5倍且不产乙酸，属于非典型产乙醇表型；（3）采用同步糖化与混合糖发酵（SSMSF）集成工艺，利用稻草水解液成功实现多糖同步利用，减少了纤维素酶用量并缩短了操作时间。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactobacillus pentosus JH5XP5 | 糖酵解/异型乳酸发酵 | — | — | 催化 | 碳分解代谢物阻遏负突变株，同时利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，异常高产乙醇 |
| Lactobacillus pentosus JH5 | 糖酵解/异型乳酸发酵 | — | — | 催化 | 原始宿主菌株，表现出典型CCR，木糖在葡萄糖耗尽后才被利用 |
| Lactobacillus pentosus NRRL B-227 | 糖酵解/异型乳酸发酵 | — | — | 催化 | 模式菌株，对照实验显示典型CCR表型 |
| — | 碳分解代谢物阻遏（CCR）调控 | ccpA | CcpA | 调控 | 参考文献中提及CcpA介导的葡萄糖抑制 |
| — | 木糖代谢 | xylAB | 木糖异构酶/木酮糖激酶 | 催化 | L. pentosus xylAB操纵子，受CCR调控 |
| — | 果糖代谢/甘露醇合成 | mdh | 甘露醇脱氢酶 | 催化 | 在果糖单碳源时产生甘露醇，与葡萄糖共利用时甘露醇消失转而产乙醇 |
| Lactobacillus pentosus JH5XP5 | 纤维素糖化 | — | 纤维素酶（Spezyme CP）、纤维二糖酶（Novozyme 188） | 催化 | 用于酸预处理稻草的同步糖化，酶活未受发酵影响 |
关键发现
- JH5XP5在24 h内同时消耗10 g/L葡萄糖和10 g/L木糖，产乳酸12.0 g/L、乙酸5.0 g/L、乙醇2.3 g/L，比生长速率为0.26 h-1
- 以葡萄糖、半乳糖、麦芽糖为单一碳源时，乙醇摩尔产率分别为1.41、1.36、2.60 mmol/mmol，为乳酸（0.60、0.51、1.27 mmol/mmol）的2.0-2.5倍，乙酸产量极低（0.02-0.03 mmol/mmol）
- 在葡萄糖与木糖、阿拉伯糖、核糖等混合发酵中，各糖同时消耗，葡萄糖与半乳糖混合时乙醇产率为1.09 mmol/mmol，乳酸为0.56 mmol/mmol
- 补料分批发酵中，30 g/L葡萄糖、10 g/L木糖和10 g/L阿拉伯糖在16 h内同时消耗，最终产物乳酸67 g/L、乙酸27 g/L（净产24.5 g/L）、乙醇13 g/L
- 顺序水解发酵稻草时，发酵21 h完成，最终乳酸25.3 g/L、乙酸14.3 g/L（净产11.8 g/L）、乙醇3.7 g/L，糖产率乳酸1.12 mol/mol、乙酸0.36 mol/mol、乙醇0.39 mol/mol
- SSMSF补料发酵中，最终乳酸43.0 g/L、乙酸15.7 g/L（净产13.2 g/L）、乙醇12.1 g/L，额外酶解后仅增加葡萄糖3.2 g/L，确认发酵48 h结束。
研究结论
L. pentosus JH5XP5是一株稳定的碳分解代谢物阻遏阴性突变株，能够同时利用木质纤维素来源的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，并在六碳糖代谢中表现出非典型的高乙醇产率（乙醇/乳酸摩尔比达2.0-2.5），且不产乙酸。将其用于酸预处理稻草的同步糖化和混合糖发酵（SSMSF），可实现混合糖同步消耗、无底物抑制，并显著降低纤维素酶用量和整体操作时间，为木质纤维素生物炼制提供了高效菌株和集成工艺。