高级醇 · 代谢工程文献库

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Cellulosic ethanol production by Zymomonas mobilis harboring an endoglucanase gene from Enterobacter cloacae

作者
P. Thirumalai Vasan, P. Sobana Piriya, D. Immanual Gilwax Prabhu, S. John Vennison
单位
Department of Biotechnology, Anna University Tiruchirappalli, Tiruchirappalli 620024, Tamil Nadu, India
杂志
Bioresource Technology（2010）
DOI
10.1016/j.biortech.2010.09.110
所属领域
发酵工程
关键词
CelluloseE. cloacaeEthanolTermiteZ. mobilis
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解决的核心问题

天然微生物中缺乏兼具纤维素降解和乙醇发酵能力的菌株，导致木质纤维素生物乙醇生产需分步进行，效率低、成本高。

研究策略

从白蚁肠道分离出产纤维素酶的Enterobacter cloacae，克隆其内切葡聚糖酶基因并转入产乙醇菌株Zymomonas mobilis，使重组菌同时获得纤维素酶活性和乙醇发酵能力，实现直接利用纤维素底物生产乙醇。

研究路线图

100%
研究问题：天然菌株缺乏纤维素降解与乙醇发酵双重能力，导致分步生产效率低
策略：从白蚁肠道分离产纤维素酶E. cloacae，克隆内切葡聚糖酶基因
关键改造：基因转入Z. mobilis MTCC 92（pKT230载体），获重组菌株
结果1：重组菌获得纤维素酶活性（滤纸酶活0.134 FPU/ml，内切葡聚糖酶活5.79 IU/ml）
结果2：重组菌直接利用CMC产乙醇5.5%（V/V），产率显著提升
结果3：重组菌直接利用碱预处理甘蔗渣产乙醇4%（V/V），为原始菌株3倍以上
结论1：实现单步整合生物加工（CBP），无需分步水解与发酵
结论2：共表达多种纤维素酶（酶鸡尾酒）可进一步提升产量，为工业应用提供策略
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核心内容

从白蚁肠道中分离到一株产纤维素酶的Enterobacter cloacae JV，从中克隆了编码糖苷水解酶家族8内切-1,4-β-D-葡聚糖酶的基因（1083 bp，约40.3 kDa），并转入产乙醇菌株Zymomonas mobilis中进行功能性表达。重组菌的滤纸酶活达0.134 FPU/ml，内切葡聚糖酶活为5.79 IU/ml；以CMC为底物时乙醇产量达5.5%（V/V），以4% NaOH预处理的甘蔗渣为底物时乙醇产量为4%（V/V），是原始E. cloacae（1.2%）的3倍以上，而野生型Z. mobilis虽能以葡萄糖产乙醇12%（V/V），却完全不能利用纤维素。研究还发现纤维素酶主要定位于周质空间，证明Z. mobilis能正确识别异源分泌信号。该工作实现了在同一菌株内同步完成纤维素降解与乙醇发酵的单步整合生物加工，避免了传统两步法中酶生产和发酵分步进行的低效与高成本。结果表明重组Z. mobilis可直接利用碱预处理甘蔗渣等纤维素底物生产乙醇，进一步通过共表达多种纤维素酶构建纤维素酶鸡尾酒，有望为工业规模纤维素乙醇生产提供可行策略。

创新点

['首次在Zymomonas mobilis中功能性表达Enterobacter cloacae的内切葡聚糖酶基因，重组菌能直接利用CMC和碱预处理甘蔗渣产乙醇。', '实现了在同一菌株内同步进行纤维素降解和乙醇发酵的单步生物加工，避免了传统两步法。', '阐明了重组菌中纤维素酶主要定位于周质空间，分泌信号被Z. mobilis正确识别。']

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Enterobacter cloacae JV 纤维素降解 内切葡聚糖酶基因（1083 bp ORF，糖苷水解酶家族8） 内切-1,4-β-D-葡聚糖酶 催化 从白蚁肠道分离，分泌胞外纤维素酶，滤纸酶活0.197 FPU/ml，产乙醇1.2%（V/V）。
Zymomonas mobilis MTCC 92 纤维素降解与乙醇发酵 来自E. cloacae的内切葡聚糖酶基因（克隆于pKT230） 内切-1,4-β-D-葡聚糖酶 催化 重组菌获得纤维素酶活性，能利用CMC和碱预处理甘蔗渣产乙醇，滤纸酶活0.134 FPU/ml，内切葡聚糖酶活5.79 IU/ml。
Escherichia coli BL21 重组表达 内切葡聚糖酶基因（克隆于pET20b(+)） 内切-1,4-β-D-葡聚糖酶 催化 用于基因克隆和表达验证，内切葡聚糖酶活6.75 IU/ml，滤纸酶活0.201 FPU/ml。

关键发现

  1. 从白蚁肠道分离的E. cloacae JV滤纸酶活最适pH6、30°C，克隆的2.25 kb DNA片段含1083 bp ORF，编码约40.3 kDa的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶（GH8家族）。重组Z. mobilis的滤纸酶活为0.134 FPU/ml，内切葡聚糖酶活为5.79 IU/ml
  2. 以CMC为底物乙醇产量为5.5%（V/V），以4% NaOH预处理甘蔗渣为底物乙醇产量为4%（V/V），是原始E. cloacae（1.2%）的3倍以上。野生型Z. mobilis以葡萄糖产乙醇12%（V/V），但不能利用纤维素。对照pET-Cel在E. coli中内切葡聚糖酶活为6.75 IU/ml，滤纸酶活0.201 FPU/ml。4% NaOH预处理使甘蔗渣纤维素含量达78.33%，结晶指数0.52±0.13。

研究结论

重组Z. mobilis能在厌氧条件下直接利用CMC和碱预处理甘蔗渣生产乙醇，实现了整合生物加工；通过共表达多种纤维素酶（纤维素酶鸡尾酒）可进一步提高乙醇产量，为工业规模纤维素乙醇生产提供了可行策略。