High efficient expression of cellobiase gene from Aspergillus niger in the cells of Trichoderma reesei
- 作者
- Bingbing Wang, Liming Xia
- 单位
- Department of Chemical Engineering and Bioengineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China
- 杂志
- Bioresource Technology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2010.12.099
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
里氏木霉纤维素酶系中纤维二糖酶活性低，导致纤维二糖积累并反馈抑制纤维素水解，限制了糖化效率。需要构建高效分泌表达纤维二糖酶的重组里氏木霉。
研究策略
克隆黑曲霉纤维二糖酶基因，与里氏木霉强启动子Pcbh1及其信号肽和终止子Tcbh1构建表达盒，连同潮霉素抗性标记重组为单质粒pHB9；通过优化的PEG-CaCl2法转化里氏木霉原生质体，实现纤维二糖酶的过表达和分泌。
研究路线图
核心内容
针对里氏木霉纤维二糖酶活性低、纤维二糖积累反馈抑制纤维素水解的问题，该研究将黑曲霉纤维二糖酶基因与里氏木霉强启动子Pcbh1、信号肽及终止子Tcbh1构建单质粒pHB9（含潮霉素抗性标记），并通过优化的PEG-CaCl₂法转化里氏木霉ZU-02原生质体。实验中改用廉价的蜗牛酶制备原生质体，优化了转化条件。结果表明，最佳条件下每微克DNA可获99至113个转化子；重组纤维二糖酶分子量约120 kDa，48小时发酵后酶活最高达5.3 IU/ml，为宿主菌（0.05 IU/ml）的106倍，同时滤纸酶活达4.33 IU/ml，为宿主的1.44倍，CB/FPA比值由0.02升至1.22。在玉米芯残渣糖化中，重组菌水解率达84.2%（宿主菌为69.5%），还原糖58.78 g/L，葡萄糖52.6 g/L，纤维二糖完全消失（宿主菌积累9.36 g/L）。这证明该重组菌粗酶液可直接用于木质纤维素糖化，无需外源补充纤维二糖酶，大幅提升效率并降低成本。
创新点
利用强启动子Pcbh1及其信号肽实现黑曲霉纤维二糖酶在里氏木霉中的高效分泌表达；采用单质粒pHB9（含表达盒和潮霉素抗性标记）简化筛选；优化了PEG浓度、孵育时间、酶解时间及原生质体浓度等转化条件；使用廉价的蜗牛酶替代昂贵的Novozym 234和lysing enzymes制备原生质体。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Trichoderma reesei ZU-02 | 纤维素降解 | cellobiase (bgl) from Aspergillus niger | 纤维二糖酶（β-葡萄糖苷酶） | 催化 | 异源表达，受Pcbh1启动子控制并利用其信号肽分泌，分子量约120 kDa，最高酶活5.3 IU/ml |
| Trichoderma reesei ZU-02 | 纤维素降解 | cbh1 启动子（Pcbh1）及其信号肽和终止子（Tcbh1） | 纤维二糖水解酶I的调控元件 | 调控 | 用于驱动和分泌外源纤维二糖酶基因表达 |
| Trichoderma reesei ZU-02 | 无（抗性筛选） | hph (hygromycin B phosphotransferase) | 潮霉素B磷酸转移酶 | 催化 | 作为筛选标记，受Pgki1启动子驱动 |
| Trichoderma reesei ZU-02 | 无（抗性筛选） | Ppki1 (pyruvate kinase promoter) | 丙酮酸激酶启动子 | 调控 | 驱动潮霉素B磷酸转移酶基因表达 |
关键发现
- 最佳转化条件下每μg DNA可获得99-113个转化子
- 重组纤维二糖酶分子量约120 kDa
- 48 h发酵后纤维二糖酶活最高达5.3 IU/ml，是宿主菌（0.05 IU/ml）的106倍
- 重组菌滤纸酶活（FPA）达4.33 IU/ml，为宿主菌（3.00 IU/ml）的1.44倍
- CB/FPA比值达1.22（宿主菌仅0.02）
- 玉米芯残渣糖化中，重组菌水解率84.2%，比宿主菌69.5%高21%，还原糖达58.78 g/L，葡萄糖52.6 g/L，纤维二糖为0（宿主菌为9.36 g/L），木糖4.88 g/L，其他糖1.29 g/L。
研究结论
成功构建了含黑曲霉纤维二糖酶基因的重组质粒pHB9，转化里氏木霉后实现了纤维二糖酶的高效表达与分泌，显著提高了纤维二糖酶活性和滤纸酶活，重组菌的粗酶液可直接用于木质纤维素生物质糖化，无需额外添加纤维二糖酶。