Fermentation of cellobiose to ethanol by industrial Saccharomyces strains carrying the β-glucosidase gene (BGL1) from Saccharomycopsis fibuligera
- 作者
- Leontina Gurgu, Álvaro Lafraya, Julio Polaina, Julia Marín-Navarro
- 单位
- Department of Biotechnology, Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos, CSIC, Paterna, Valencia, Spain
- 杂志
- Bioresource Technology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2011.01.062
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
比较不同Saccharomyces工业菌株中纤维二糖酶基因BGL1的表达效率及利用纤维二糖产乙醇的能力，筛选适合纤维素乙醇生产的宿主菌株。
研究策略
将来源于Saccharomycopsis fibuligera的BGL1基因分别置于组成型肌动蛋白启动子和半乳糖诱导启动子控制下，转化11种Saccharomyces菌株，比较β-葡萄糖苷酶活性、细胞附着性及纤维二糖发酵产乙醇性能，并分析呼吸作用对乙醇产量的影响。
研究路线图
核心内容
该研究将来源于Saccharomycopsis fibuligera的β-葡萄糖苷酶基因BGL1分别置于组成型肌动蛋白启动子和半乳糖诱导型启动子控制下，转化11种工业酿酒酵母菌株，系统比较了不同菌株中异源蛋白表达、β-葡萄糖苷酶活性及利用纤维二糖发酵产乙醇的性能。结果显示，组成型启动子驱动的BGL1表达量比诱导型启动子高1.6至18倍；重组菌株的β-葡萄糖苷酶活性介于33至250 mU/mL，其中T500活性最高。在纤维二糖发酵中，T500、T491和T499菌株产乙醇超过100 g/L，而T28和T74低于7 g/L，菌株间差异显著。进一步分析发现，线粒体呼吸活性对纤维二糖产乙醇具有负面影响，如同为BGL1表达菌株的petite突变体T499，其酶产量比亲本T491低3倍但乙醇产量相近，表明低呼吸活性有利于乙醇积累。研究还发现纤维二糖发酵分为水解与发酵两个阶段，β-葡萄糖苷酶合成需超过使水解成为限速步骤的阈值。该工作筛选出的T500等菌株可作为纤维素乙醇生产的优良候选宿主，同时提示在利用非葡萄糖底物时需兼顾菌株的蛋白表达能力与低葡萄糖浓度下的发酵性能。
创新点
1) 系统比较了组成型与诱导型启动子在多种工业酵母中的表达差异；2) 发现线粒体呼吸活性对纤维二糖产乙醇有负面影响；3) 筛选出多个高产乙醇的工业菌株作为纤维素乙醇生产的候选宿主。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (BY4741, FJF135, FJF305, Y370, LA1, LA1 p0, Y111), S. bayanus (NYCY1324), S. pastorianus (NYCY512等) | 纤维二糖水解与乙醇发酵途径 | BGL1 | Bgl1 | 催化 | 来自Saccharomycopsis fibuligera的β-葡萄糖苷酶，水解纤维二糖为葡萄糖 |
| Saccharomyces cerevisiae (各转化菌株) | 基因表达调控 | pACT1 | — | 调控 | 组成型肌动蛋白启动子，驱动BGL1表达 |
| Saccharomyces cerevisiae (各转化菌株) | 基因表达调控 | GAL10/CYC | — | 调控 | 半乳糖诱导型启动子，驱动BGL1表达 |
| Saccharomyces cerevisiae (各转化菌株) | 分泌途径 | STA1 | STA1信号肽 | 转运 | 来自S. cerevisiae var. diastaticus STA1的信号肽，引导Bgl1分泌并锚定于细胞表面 |
| Saccharomyces cerevisiae LA1 p0 (T499) | 呼吸代谢 | — | — | 能量供给 | 线粒体petite突变株，呼吸活性低，但纤维二糖产乙醇能力与亲本T491相当 |
关键发现
- 在10个重组菌株中，肌动蛋白启动子驱动的BGL1表达量比半乳糖诱导启动子高1.6~18倍
- β-葡萄糖苷酶活性范围为33~250 mU/mL，其中T500最高达250 mU/mL
- 利用纤维二糖发酵时，T500、T491、T499产乙醇超过100 g/L，T75约70 g/L，T370、T111、T101、T92、T93为30~50 g/L，T28和T74低于7 g/L
- petite突变株T499的β-葡萄糖苷酶产量比亲本T491低3倍，但乙醇产量相似
- 葡萄糖发酵时6个菌株接近理论最大产量（0.511 g乙醇/g葡萄糖），其余5个菌株为理论产值的40%~60%。
研究结论
要利用纤维二糖等非葡萄糖底物生产乙醇，需同时考虑菌株的异源蛋白表达能力和低葡萄糖浓度下的发酵性能。纤维二糖发酵分为水解和发酵两个阶段，β-葡萄糖苷酶合成需超过使水解成为限速步骤的阈值，而低呼吸活性有利于提高乙醇产量。本研究筛选出的菌株是纤维素乙醇生产的优良候选宿主。