Bio-isoprene production using exogenous MVA pathway and isoprene synthase in Escherichia coli
- 作者
- Jianming Yang, Guang Zhao, Yuanzhang Sun, Yanning Zheng, Xinglin Jiang, Wei Liu, Mo Xian
- 单位
- Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences; School of Food and Bioengineering, Shandong Polytechnic University
- 杂志
- Bioresource Technology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2011.10.042
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异戊二烯是重要的平台化学品，目前工业生产依赖石化资源；生物合成中微生物内源MEP途径受宿主调控机制限制，导致产量低、难以工业化。
研究策略
在E. coli BL21(DE3)中异源表达酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的完整MVA途径，并共表达经密码子优化的毛果杨（Populus alba）异戊二烯合酶（IspS），绕过内源MEP途径的调控，提高DMAPP供给，从而实现异戊二烯的高产。
核心内容
针对大肠杆菌内源MEP途径受宿主调控限制导致异戊二烯产量低的问题，本研究在E. coli BL21(DE3)中异源表达了来自酿酒酵母的完整甲羟戊酸（MVA）途径，并共表达了经密码子优化的毛果杨异戊二烯合酶（IspS），以绕过内源调控、增强DMAPP供给。通过比较三个来源的IspS，筛选出活性最高的毛果杨酶。摇瓶培养中，携带完整MVA途径和IspS的重组菌YJM13产量达2.48 mg/L，较仅表达IspS的对照提高2.9倍；补料分批发酵中该菌株产量进一步提升至532 mg/L，约为对照的5倍，为当时报道的最高水平。体外酶活实验证实纯化的IspS_Pa（64 kDa）可直接催化DMAPP生成异戊二烯。该研究首次在E. coli中建立外源MVA途径与异戊二烯合酶的组合，证明了绕过内源调控策略的可行性，为利用可再生资源工业化生产异戊二烯提供了有效平台。
创新点
首次在E. coli中建立外源MVA途径与异戊二烯合酶的组合；筛选出三个来源中活性最高的P. alba IspS；通过补料分批发酵将异戊二烯产量提升至当时报道的最高水平。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | ERG10 | acetoacetyl-CoA thiolase | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化乙酰-CoA生成乙酰乙酰-CoA |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | ERG13 | HMG-CoA synthase | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化乙酰乙酰-CoA生成HMG-CoA |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | tHMGR | truncated HMG-CoA reductase | 催化 | 来自S. cerevisiae，截短形式，催化HMG-CoA生成甲羟戊酸 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | ERG12 | mevalonate kinase | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化甲羟戊酸磷酸化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | ERG8 | phosphomevalonate kinase | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | ERG19 | mevalonate pyrophosphate decarboxylase | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化甲羟戊酸焦磷酸脱羧 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | IDI1 | IPP isomerase | 催化 | 来自S. cerevisiae，催化IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | ispS_Pa | isoprene synthase from Populus alba | 催化 | 密码子优化的ispS基因，催化DMAPP生成异戊二烯；在三个来源中活性最高 |
关键发现
- 摇瓶条件下，重组菌株YJM13（同时携带MVA途径和ispS_Pa）积累异戊二烯2.48 mg/L，较仅含ispS_Pa的YJM8（0.86 mg/L）提高2.9倍
- 补料分批发酵中YJM13产量达532 mg/L，为YJM8（110 mg/L）的约5倍。筛选实验中，YJM8、YJM9、YJM10的异戊二烯产量分别为0.86、0.12、0.65 mg/L。在外源MVA补充实验中，含pYJM14（MVA下游途径）的菌株在添加2.5 mM MVA时异戊二烯产量为52±4 mg/L，比未添加（0.78±0.045 mg/L）高约60倍
- 而仅含空载体的菌株添加MVA后产量无明显变化。体外酶活实验证实纯化的IspS_Pa（64 kDa）可催化DMAPP生成异戊二烯。
研究结论
本研究通过在E. coli中引入酿酒酵母MVA途径并共表达毛果杨异戊二烯合酶，成功构建了异戊二烯生物合成系统，补料分批发酵产量达532 mg/L，为当时报道的最高水平，为利用可再生资源工业化生产异戊二烯提供了可行策略。