Functional expression of a valence dioxynenase from Pleurotus sapidus in E. coli
- 作者
- Kateryna Zelena, Ulrich Krings, Ralf G. Berger
- 单位
- Gottfried Wilhelm Leibniz University Hannover, Institute of Food Chemistry
- 杂志
- Bioresource Technology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2011.12.097
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何在E. coli中实现来自真菌Pleurotus sapidus的缬草烯双加氧酶（ValOx）的功能性可溶表达，以高效生物转化(+)-缬草烯生成高价值葡萄柚香料(+)-诺卡酮。
研究策略
克隆ValOx全长cDNA，构建周质表达（pBAD/gIII）和冷休克表达（pCold I）载体，通过冷休克诱导、伴侣蛋白（trigger factor、GroEL-GroES）共表达及多种大肠杆菌宿主（TOP10、LMG194、BL21(DE3)Star）筛选优化，获得可溶活性酶。
核心内容
本研究从真菌Pleurotus sapidus中克隆了缬草烯双加氧酶（ValOx）全长cDNA（1929 bp，编码643个氨基酸），并首次在大肠杆菌中实现了该真菌双加氧酶的功能性异源表达。为解决包涵体问题，作者构建了周质表达（pBAD/gIII）和冷休克表达（pCold I）载体，通过在8°C下冷休克诱导并结合trigger factor伴侣共表达，在BL21(DE3)Star菌株中获得了高水平可溶活性酶，1 L培养物可得到60 mg功能性ValOx。纯化后的重组酶（2 mg）在Na-cholate存在下转化(+)-缬草烯，生成80 mg/L(+)-诺卡酮、32 mg/L α-nootkatol和16 mg/L β-nootkatol，产物比例与天然酶一致，LC-MS确认了氢过氧化物中间体。值得注意的是，该酶无需任何氧化还原辅因子即可催化烯丙位氧化，产物得率显著高于P450系统。该策略为无辅因子真菌氧化酶在大肠杆菌中的功能表达提供了有效途径，也为葡萄柚香料(+)-诺卡酮的生物技术生产奠定了基础。
创新点
首次报道真菌双加氧酶cDNA的克隆与功能异源表达；冷休克启动子与触发因子共表达策略成功解决包涵体问题；重组ValOx无需任何氧化还原辅因子即可催化(+)-缬草烯的烯丙位氧化，产物得率显著高于P450系统。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)Star | 倍半萜氧化（(+)-缬草烯 → (+)-诺卡酮） | ValOx (valencene dioxygenase cDNA) | 缬草烯双加氧酶 ValOx | 催化 | 目标重组酶，异源表达实现缬草烯选择性烯丙位氧化为诺卡酮 |
| Escherichia coli BL21(DE3)Star | 蛋白折叠辅助 | tig (trigger factor) | 触发因子 Trigger factor | 调控 | 分子伴侣共表达，维持新生蛋白开放构象，显著提高ValOx可溶性 |
| Escherichia coli TOP10 | 蛋白折叠辅助 | groES/groEL | GroEL-GroES 伴侣蛋白 | 调控 | 热休克伴侣蛋白共表达，辅助折叠并减少聚集，但对ValOx可溶性提升效果弱于单独trigger factor |
关键发现
- 通过冷休克表达（cspA启动子，8°C，BL21(DE3)Star菌株）并共表达trigger factor，1 L培养物可获得高达60 mg可溶且生物活性的ValOx
- 纯化后的重组酶（2 mg）在表面活性剂Na-cholate存在下转化(+)-valencene，生成80 mg/L(+)-nootkatone、32 mg/L α-nootkatol和16 mg/L β-nootkatol，产物比例与天然酶一致
- LC-MS确认中间体氢过氧化物生成
- ValOx全长cDNA为1929 bp，编码643个氨基酸，计算分子量72.3 kDa，等电点5.33。
研究结论
冷休克表达结合trigger factor伴侣共表达实现了ValOx在大肠杆菌中的高水平可溶功能表达，重组酶可高效将(+)-缬草烯转化为(+)-诺卡酮及诺卡醇，且不需辅因子，为葡萄柚香料的生物技术生产提供了有效途径。