Use of an osmotically sensitive mutant of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii for the simultaneous productions of organic acids and trehalose from biodiesel waste based crude glycerol
- 作者
- Rohit Ruhal, Bijan Choudhury
- 单位
- Bioprocess Engineering Laboratory, Department of Biotechnology, Indian Institute of Technology (IIT), Roorkee, India
- 杂志
- Bioresource Technology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2012.01.039
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用生物柴油废粗甘油生产海藻糖时产量较低，需要通过菌株改造提高海藻糖积累效率，并同时生产丙酸、乳酸等有机酸，实现废弃物的高值化利用。
研究策略
采用EMS化学诱变筛选渗透压敏感突变株（在含3% NaCl培养基中不能生长），利用该突变株在非胁迫条件下增强海藻糖积累；以粗甘油为碳源进行静态摇瓶和批次发酵，并通过酶活分析解析代谢机制。
核心内容
以生物柴油废粗甘油为碳源，利用经EMS化学诱变获得的渗透压敏感突变株（在含3% NaCl培养基中不能生长）提升海藻糖积累，并同时生产丙酸和乳酸。突变株以粗甘油为底物时，海藻糖产量达391 mg/g生物量（Ytx）和90 mg/g底物消耗（Yts），分别为亲本菌株的3倍和4倍；静态摇瓶条件下最高产量可达685±25 mg/g生物量，最终为412±22 mg/g生物量，约合生物量的41%，为当时报道最高值。同时联产丙酸（0.42 g/g底物）和乳酸（0.3 g/g底物）。酶活分析表明，突变株ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性较亲本高约18倍，GDP-葡萄糖焦磷酸化酶高6.5倍，海藻糖酶高20倍，且这些酶活性随生长下降幅度远小于亲本。结果说明，渗透压敏感突变策略有效解除了海藻糖积累的限制，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶增强可能是关键机制，为废粗甘油的高值化利用提供了可行途径。
创新点
['首次获得渗透压敏感且耐尼生的Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii突变株，显著提高海藻糖产量', '发现ADP-葡萄糖焦磷酸化酶在增强海藻糖合成中的关键作用，其活性较亲本高约18倍', '实现了以粗甘油为底物同时生产海藻糖、丙酸和乳酸，海藻糖产量（以生物量计）达到41%，为当时最高报道值']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | 海藻糖生物合成 (OtsAB途径) | otsA | 海藻糖-6-磷酸合成酶 (Trehalose-6-phosphate synthetase) | 催化 | 催化UDP-葡萄糖/GDP-葡萄糖/ADP-葡萄糖与葡萄糖-6-磷酸合成海藻糖-6-磷酸，突变株中活性较亲本高1.2倍 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | NDP-葡萄糖合成 | — | ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 | 催化 | 催化ADP-葡萄糖合成，突变株活性较亲本高约18倍，是海藻糖增产的关键因素 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | NDP-葡萄糖合成 | — | GDP-葡萄糖焦磷酸化酶 | 催化 | 催化GDP-葡萄糖合成，突变株活性较亲本高6.5倍 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | NDP-葡萄糖合成 | — | UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 | 催化 | 催化UDP-葡萄糖合成，突变株活性较亲本高1.3倍 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | 海藻糖降解 | — | 海藻糖酶 | 催化 | 降解海藻糖，突变株活性较亲本高20倍，但海藻糖净积累仍显著增加 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | 糖酵解/戊糖磷酸途径 | — | 葡萄糖-6-磷酸异构酶 | 催化 | 催化葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸互变，突变株与亲本活性差异不大 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | 戊糖磷酸途径 | — | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | PPP途径关键酶，突变株与亲本活性差异不大 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | UDP-葡萄糖代谢 | — | UDP-葡萄糖脱氢酶 | 催化 | 突变株活性较亲本低约6倍，可能有利于海藻糖合成 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | 糖酵解 | — | 磷酸葡萄糖变位酶 | 催化 | 催化葡萄糖-6-磷酸与葡萄糖-1-磷酸互变，突变株与亲本活性差异不大 |
| Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NCIM 5137 渗透敏感突变株 | 糖酵解 | — | 果糖-1,6-二磷酸酶 | 催化 | 参与糖异生，突变株与亲本活性差异不大 |
关键发现
- 以粗甘油为碳源时，突变株海藻糖产量达391 mg/g生物量（Ytx）、90 mg/g底物消耗（Yts），分别是亲本菌株的3倍和4倍
- 同时获得丙酸0.42 g/g底物、乳酸0.3 g/g底物。静态摇瓶条件下最高海藻糖产量为685±25 mg/g生物量，最终412±22 mg/g生物量（约41%生物量）。批次发酵中，纯甘油时最高Ytx为376±16 mg/g，Yts为80±5 mg/g
- 粗甘油时最高Ytx为530±16 mg/g，最终Ytx为391±14 mg/g，Yts最高142±10 mg/g、最终90±5 mg/g。突变株ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性较亲本高约18倍，GDP-葡萄糖焦磷酸化酶高6.5倍，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶高1.3倍，海藻糖酶活性高20倍
- 且突变株中这些酶活性随生长下降幅度远小于亲本。
研究结论
渗透压敏感突变株显著提高了粗甘油产海藻糖的效率，同时联产丙酸和乳酸，为粗甘油的高值化利用提供了有效途径。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性增强可能是海藻糖积累提高的关键原因。