Metabolic engineering of Klebsiella oxytoca M5a1 to produce optically pure D-lactate in mineral salts medium
- 作者
- Maytawadee Sangproo, Pattharasedthi Polyiam, Sirima Suvarnakuta Jantama, Sunthorn Kanchanatawee, Kaemwich Jantama
- 单位
- Metabolic Engineering Research Unit, School of Biotechnology, Institute of Agricultural Technology, Suranaree University of Technology, 111 University Avenue, Suranaree Sub-District, Muang District, Nakhon Ratchasima 30000, Thailand; Division of Biopharmacy, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ubon Ratchathani University, Warinchamrap, Ubon Ratchathani 34190, Thailand
- 杂志
- Bioresource Technology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2012.05.114
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型Klebsiella oxytoca M5a1在厌氧发酵中产生乙醇、乙酸、2,3-丁二醇等多种副产物，D-乳酸产量低且光学纯度不足，需要低成本、高纯度生产D-乳酸。
研究策略
通过同源重组敲除染色体上的adhE（乙醇脱氢酶）和pta-ackA（磷酸转乙酰酶/乙酸激酶）基因，阻断乙醇和乙酸合成途径，使NADH再生主要依赖乳酸脱氢酶（LdhA），从而将碳流导向D-乳酸生产；利用K. oxytoca天然的底物谱，在AM1低盐培养基中进行pH-controlled分批发酵。
核心内容
本研究通过同源重组敲除Klebsiella oxytoca M5a1染色体上的adhE及pta-ackA基因，阻断乙醇和乙酸合成途径，使NADH再生主要依赖乳酸脱氢酶，将碳流导向D-乳酸生产。在AM1低盐培养基中进行pH-controlled分批发酵，两株工程菌KMS002（ΔadhE）和KMS004（ΔadhE Δpta-ackA）在2%葡萄糖条件下分别产D-乳酸13.13 g/L和11.46 g/L，产率0.71和0.64 g/g；以50 g/L麦芽糊精为底物时，产量分别达33.63 g/L和32.95 g/L，产率约0.92 g/g。两菌株D-乳酸光学纯度均达99.5%，且副产物显著减少，KMS002中乙醇和1,3-丙二醇未检出。结果表明，K. oxytoca可高效利用廉价底物生产光学纯D-乳酸，无需复杂营养物或抗生素，产量和产率优于已报道的工程大肠杆菌，为低成本生物合成D-乳酸提供了有前景的菌株平台。
创新点
首次将K. oxytoca M5a1改造为光学纯D-乳酸生产者；利用其天然利用蔗糖和麦芽糊精的能力，在无复杂营养物、无抗生素条件下实现高产量和高产率；D-乳酸光学纯度达99.5%。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella oxytoca M5a1 | D-乳酸生产途径 | ldhA | 乳酸脱氢酶 LdhA | 催化 | 内源酶，负责丙酮酸还原为D-乳酸，是改造后主要的NADH再生途径 |
| Klebsiella oxytoca M5a1 | 乙醇发酵途径 | adhE | 乙醇脱氢酶 AdhE | 催化 | 删除该基因构建KMS002，阻断乙醇生成 |
| Klebsiella oxytoca M5a1 | 乙酸合成途径 | pta-ackA | 磷酸转乙酰酶/乙酸激酶 (Pta-AckA) | 催化 | 删除该基因构建KMS004，减少乙酸副产物；但KMS004中乙酸仍通过PoxB/TdcD产生 |
关键发现
- 在含2%(w/v)葡萄糖的AM1培养基中，KMS002（ΔadhE）和KMS004（ΔadhE Δpta-ackA）分别产生13.13±0.45 g/L和11.46±0.09 g/L D-乳酸，产率分别为0.71±0.03 g/g和0.64±0.01 g/g，平均生产力分别为0.38±0.03和0.36±0.01 g/L/h
- 在50 g/L甘蔗糖蜜中，KMS002和KMS004分别产生24.34±0.45 g/L和21.86±0.27 g/L D-乳酸，产率为0.80-0.87 g/g总糖
- 在50 g/L麦芽糊精中，分别产生33.63±0.65 g/L和32.95±0.68 g/L D-乳酸，产率分别为0.92±0.06和0.91±0.06 g/g。两菌株D-乳酸光学纯度达99.5%，副产物显著减少（KMS002中乙醇和1,3-丙二醇未检出）。
研究结论
通过删除adhE和pta-ackA基因，K. oxytoca M5a1可高效利用葡萄糖、甘蔗糖蜜和麦芽糊精生产光学纯D-乳酸，产量和产率优于已报道的工程E. coli，且无需昂贵营养物和抗生素，是低成本生产D-乳酸的有前景菌株。进一步删除相关副产物基因和进行代谢进化有望提高生产力。