Towards Elucidating Carnosic Acid Biosynthesis in Lamiaceae: Functional Characterization of the Three First Steps of the Pathway in Salvia fruticosa and Rosmarinus officinalis
- 作者
- Dragana Božić, Dimitra Papaefthimiou, Kathleen Brückner, Ric C. H. de Vos, Constantinos A. Tsoleridis, Dimitra Katsarou, Antigoni Papanikolaou, Irini Pateraki, Fani M. Chatzopoulou, Eleni Dimitriadou, Stefanos Kostas, David Manzano, Ulschan Scheler, Albert Ferrer, Alain Tissier, Antonios M. Makris, Sotirios C. Kampranis, Angelos K. Kanellis
- 单位
- Group of Biotechnology of Pharmaceutical Plants, Laboratory of Pharmacognosy, Department of Pharmaceutical Sciences, Aristotle University of Thessaloniki, 541 24 Thessaloniki, Greece; Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Department of Cell and Metabolic Biology, Halle (Saale), Germany; Plant Research International, Wageningen University and Research Centre, The Netherlands; Laboratory of Organic Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, 541 24 Thessaloniki, Greece; Department of Molecular Genetics, Centre for Research in Agricultural Genomics (CSIC-IRTA-UAB-UB), Bellaterra-Cerdanyola del Valles, 08193 Barcelona, Spain; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Pharmacy, University of Barcelona, 08028 Barcelona, Spain; Laboratory of Floriculture, School of Agriculture, Aristotle University of Thessaloniki, 541 24 Thessaloniki, Greece; Institute of Applied Biosciences, Centre for Research and Technology Hellas, Thermi Thessaloniki, Greece; Department of Biochemistry, School of Medicine, University of Crete, P.O. Box 2208, 710 03 Heraklion, Greece; Netherlands Metabolomics Centre, Leiden, The Netherlands
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0124106
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明唇形科植物中鼠尾草酸（carnosic acid）生物合成的前几步酶学机制，特别是从希腊鼠尾草（Salvia fruticosa）和迷迭香（Rosmarinus officinalis）中鉴定并功能表征负责CDP、miltiradiene和ferruginol合成的关键酶。
研究策略
利用S. fruticosa腺毛转录组（EST和RNA-Seq）筛选候选二萜合酶和细胞色素P450基因，通过大肠杆菌、酵母和本氏烟草异源表达及体外酶活测定，结合GC-MS和NMR对产物进行结构鉴定，同时分析基因表达模式与酚类二萜积累的相关性。
核心内容
该研究旨在阐明唇形科植物鼠尾草酸生物合成的前三步酶学机制。研究者从希腊鼠尾草腺毛转录组中筛选并克隆了三个关键酶基因，包括SfCPS、SfKSL和SfFS，分别对应copalyl diphosphate合酶、kaurene synthase-like蛋白和ferruginol合酶，同时从迷迭香中鉴定了两个新的ferruginol合酶RoFS1和RoFS2。通过大肠杆菌、酵母和本氏烟草异源表达及体外酶活测定，结合GC-MS和多维NMR结构鉴定，证实SfCPS催化GGDP生成CDP，SfCPS与SfKSL偶联可合成miltiradiene，在酵母3.75 L培养中获得约20 mg纯化产物并经NMR确证；SfFS、RoFS1和RoFS2均能催化合成ferruginol。基因表达分析显示这三个基因在毛状体和幼叶中高表达，且机械损伤后3至6小时表达下调。该工作完整解析了鼠尾草酸生物合成的前三步催化反应，为在异源宿主中实现鼠尾草酸及其前体的微生物生产奠定了基础。
创新点
首次从S. fruticosa中克隆并功能表征了三个鼠尾草酸前体合成酶（SfCPS、SfKSL和SfFS），从R. officinalis中鉴定了两个新的ferruginol合酶（RoFS1和RoFS2）；利用多维NMR确证了miltiradiene结构；发现SfKSL属于缺乏γ结构域的双域二萜合酶。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | carnosic acid biosynthesis | SfCPS | SfCPS (copalyl diphosphate synthase) | 催化 | 催化GGDP环化生成copalyl diphosphate；体外活性验证，N端30个氨基酸的质体转运肽被截除 |
| Escherichia coli | carnosic acid biosynthesis | SfKSL | SfKSL (kaurene synthase-like) | 催化 | 与SfCPS偶联催化CDP生成miltiradiene；N端49个氨基酸转运肽被截除；缺乏γ结构域，属α/β双域蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae | carnosic acid biosynthesis | SfCPS, SfKSL | SfCPS + SfKSL | 催化 | 在酵母AM104菌株中共表达，成功生产miltiradiene（3.75 L培养获得约20 mg），同时检测到少量abietatriene |
| Nicotiana benthamiana | carnosic acid biosynthesis | SfCPS, SfKSL | SfCPS + SfKSL | 催化 | 通过农杆菌共浸润在本氏烟草中瞬时表达，检测到miltiradiene和abietatriene生成 |
| Saccharomyces cerevisiae | carnosic acid biosynthesis | SfFS | SfFS (ferruginol synthase, CYP76 family) | 催化 | 与SfCPS、SfKSL及CPR2共表达，催化合成ferruginol |
| Saccharomyces cerevisiae | carnosic acid biosynthesis | RoFS1 | RoFS1 (ferruginol synthase, CYP76 family) | 催化 | 与RoCPS1、RoKSL1及CPR2共表达，催化合成ferruginol；与CYP76AH4同一性87.8% |
| Saccharomyces cerevisiae | carnosic acid biosynthesis | RoFS2 | RoFS2 (ferruginol synthase, CYP76 family) | 催化 | 与RoCPS1、RoKSL1及CPR2共表达，催化合成ferruginol；与CYP76AH4同一性85.6% |
| Nicotiana benthamiana | carnosic acid biosynthesis | SfFS, RoFS1, RoFS2 | SfFS / RoFS1 / RoFS2 | 催化 | 分别与SfCPS、SfKSL及AtCPR1共浸润，在本氏烟草叶片中均检测到ferruginol生成 |
关键发现
- SfCPS和SfKSL的ORF分别为2391 bp和1755 bp，分别编码copalyl diphosphate synthase和kaurene synthase-like蛋白，SfCPS与RoCPS1氨基酸同一性88%，SfKSL与RoKSL2同一性85%
- SfCPS在体外催化GGDP生成copalol（去磷酸化产物），SfCPS与SfKSL偶联可合成miltiradiene，并在酵母中通过3.75 L培养获得约20 mg纯化产物，经1D/2D NMR确证
- SfFS、RoFS1和RoFS2在酵母和本氏烟草中表达均能催化合成ferruginol，证明其为ferruginol synthase
- RoFS1和RoFS2与CYP76AH4的蛋白序列同一性分别为87.8%和85.6%
- S. fruticosa基因型Kavoussi的酚类二萜（鼠尾草酸+鼠尾草酚）含量最高，幼叶积累量显著高于老叶，毛状体中鼠尾草酸含量高而鼠尾草酚主要在无毛叶片中
- SfCPS、SfKSL和SfFS在毛状体和幼叶中高表达，机械损伤后3-6小时表达下调
- SfKSL缺乏γ结构域，仅含α/β双域结构。
研究结论
该研究阐明了鼠尾草酸生物合成的前三步：GGDP→CDP（由SfCPS催化）、CDP→miltiradiene（由SfKSL催化）以及miltiradiene/abietatriene→ferruginol（由SfFS/RoFS1/RoFS2催化），为在异源宿主中实现鼠尾草酸及其前体的微生物生产奠定了基础。