Construction of homologous and heterologous synthetic sucrose utilizing modules and their application for carotenoid production in recombinant Escherichia coli
- 作者
- Jong Rae Kim, Se Hyeuk Kim, Sang Yup Lee, Pyung Cheon Lee
- 单位
- Department of Molecular Science and Technology, Ajou University; Department of Biotechnology, Ajou University; Department of Bio and Brain Engineering and Bioinformatics Research Center, KAIST; Department of Biological Sciences, KAIST
- 杂志
- Bioresource Technology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2012.11.148
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
野生型大肠杆菌K12不能利用蔗糖作为碳源，限制了其在工业发酵中的应用。本研究旨在通过构建合成蔗糖利用模块，赋予E. coli K12蔗糖利用能力，并应用于类胡萝卜素生产。
研究策略
从不同来源（Lactobacillus plantarum、Staphylococcus xylosus、E. coli EC3132）克隆蔗糖利用途径基因（PEP-PTS和非PTS途径），构建可切换的模块化表达载体，在E. coli K12中组成型表达，筛选功能性模块，并进一步与类胡萝卜素合成模块共表达。
核心内容
本研究通过模块化合成生物学策略，从植物乳杆菌、木糖葡萄球菌和大肠杆菌EC3132等不同来源克隆蔗糖利用途径基因，构建了PEP-PTS与非PTS两类可切换的合成模块，并在大肠杆菌K12中组成型表达以赋予其蔗糖利用能力。结果显示，非PTS模块中仅表达蔗糖水解酶基因cscA即可恢复蔗糖利用，推测与酶蛋白周质释放有关；表达cscA-cscB-cscK模块的菌株在M9蔗糖培养基中细胞干重达0.639 g/L，产率为0.141 g/g蔗糖，而表达scrA-scrB模块的菌株干重达0.811 g/L、产率0.163 g/g蔗糖。植物乳杆菌的PTS组分不具功能，但其sacA和sacK可功能性替换对应酶。进一步将功能模块与类胡萝卜素合成模块共表达，非PTS模块产dipalycopene达1.5 mg/g-DCW（281 μg/g蔗糖），PTS模块产1.3 mg/g-DCW（108 μg/g蔗糖），且蔗糖利用不受类胡萝卜素合成影响。该工作系统比较了异源蔗糖利用途径的适配性，为以蔗糖为可再生碳源的工业发酵提供了可扩展的模块化平台。
创新点
首次通过模块化合成生物学方法系统比较了异源PEP-PTS和非PTS蔗糖利用途径在E. coli K12中的功能；构建了可开关的蔗糖利用模块，实现了同源和异源基因的灵活组装；成功将功能模块应用于类胡萝卜素生产，展示了其在工业生物技术中的潜力。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K12 | 蔗糖非PTS利用途径 | cscA | 蔗糖水解酶CscA | 催化 | 来自E. coli EC3132；单独表达即可赋予蔗糖利用能力 |
| Escherichia coli K12 | 蔗糖非PTS利用途径 | cscB | 蔗糖通透酶CscB | 转运 | 来自E. coli EC3132；蔗糖/H+同向转运蛋白 |
| Escherichia coli K12 | 蔗糖非PTS利用途径 | cscK | 果糖激酶CscK | 催化 | 来自E. coli EC3132 |
| Escherichia coli K12 | 蔗糖PEP-PTS利用途径 | pts1BCA | 蔗糖磷酸转移酶Pts1BCA | 催化 | 来自Lactobacillus plantarum；在E. coli K12中不功能 |
| Escherichia coli K12 | 蔗糖PEP-PTS利用途径 | sacA | 蔗糖水解酶SacA | 催化 | 来自Lactobacillus plantarum；可与ScrA_SX组合构成异源模块 |
| Escherichia coli K12 | 蔗糖PEP-PTS利用途径 | sacK | 果糖激酶SacK | 催化 | 来自Lactobacillus plantarum |
| Escherichia coli K12 | 蔗糖PEP-PTS利用途径 | scrA | 蔗糖磷酸转移酶ScrA | 催化 | 来自Staphylococcus xylosus；与ScrB_SX组合功能 |
| Escherichia coli K12 | 蔗糖PEP-PTS利用途径 | scrB | 蔗糖水解酶ScrB | 催化 | 来自Staphylococcus xylosus |
| Escherichia coli K12 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtM | CrtM | 催化 | 用于合成dipalycopene |
| Escherichia coli K12 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtN | CrtN | 催化 | 用于合成dipalycopene |
关键发现
- 非PTS模块中，单基因CscA_EC即可赋予E. coli K12蔗糖利用能力，His-tagged CscA_EC主要定位于细胞内，推测周质释放是单基因起作用的原因。
- 表达CscA_EC-CscB_EC-CscK_EC模块的菌株在M9+2%蔗糖中OD600约2.3，细胞干重0.639 g/L，细胞产率0.141 g/g蔗糖。
- 表达ScrA_SX-ScrB_SX模块的菌株OD600约2.5，细胞干重0.811 g/L，产率0.163 g/g蔗糖；补充异源果糖激酶可缩短延滞期但不提高蔗糖消耗。
- L. plantarum的Pts1BCA_LP不功能，但SacA_LP和SacK_LP可功能性替换S. xylosus模块中的对应酶，形成ScrA_SX-SacA_LP-SacK_LP模块。
- 在产类胡萝卜素菌株中，非PTS模块(pAC-cscABK)产生dipalycopene
- 5 mg/g-DCW和281 μg/g-蔗糖（78 h），PTS模块(pAC-AAK)产生1.3 mg/g-DCW和108 μg/g-蔗糖（48 h），且模块的蔗糖利用能力不受类胡萝卜素合成影响。
研究结论
通过模块化表达来自不同来源的蔗糖利用基因，成功赋予E. coli K12蔗糖利用能力，并证明这些模块可用于类胡萝卜素生产，为利用蔗糖作为可再生碳源进行工业发酵提供了可持续的策略。