Cloning, expression and medium optimization of validamycin glycosyltransferase from Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis for the biotransformation of validoxylamine A to produce validamycin A using free resting cells

作者: Yongxian Fan, Yu Yang, Xiaoqin Jia, Xiaolong Chen, Yinchu Shen
单位: Institute of Fermentation Engineering, College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, 18# Chaowang Road, Hangzhou 310014, PR China
杂志: Bioresource Technology（2013）
DOI: 10.1016/j.biortech.2012.12.021
所属领域: 发酵工程
关键词: Streptomyces hygroscopicusValidamycin AValidamycin glycosyltransferaseValidoxylamine A
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解决的核心问题

有效霉素A是广泛使用的农用抗生素，但其商业产品中有效霉素A含量难以提升（通常含60%有效霉素A、20-30%有效氧胺A等），通过生物转化将有效氧胺A转化为有效霉素A可提高纯度，但传统方法依赖昂贵的UDP-葡萄糖和纯化酶，成本过高，难以工业化。

研究策略

从吸水链霉菌井冈变种中克隆valG基因并转入大肠杆菌BL21(DE3)表达，采用游离静息细胞作为全细胞催化剂，以廉价的D-纤维二糖替代UDP-葡萄糖作为糖供体，催化有效氧胺A转化为有效霉素A；并通过单因素实验和响应面法（Box-Behnken设计）优化发酵培养基成分，提高生物量和酶活。

研究路线图

100%

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核心内容

从吸水链霉菌井冈变种中克隆了有效霉素糖基转移酶基因valG（1269 bp，编码422个氨基酸，表达蛋白约47 kDa），并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)实现异源表达。以游离静息细胞作为全细胞催化剂，直接利用廉价的D-纤维二糖替代昂贵的UDP-葡萄糖作为糖供体，催化有效氧胺A转化为有效霉素A，避免了纯化酶的高成本步骤。通过单因素实验和Box-Behnken响应面法对发酵培养基进行系统优化，确定了最佳配方为乳糖4.7 g/L、酵母提取物49.5 g/L、氯化铵2.7 g/L、磷酸钾缓冲液110 mL/L、Ca2+ 0.0352 g/L。在此条件下，酶活达到1.49 U/mL，生物量达5.5 g/L，均为初始培养基的近两倍。该研究证明了以游离静息细胞结合廉价底物进行全细胞生物转化的可行性，大幅降低了生产成本，为有效霉素A的工业化制备奠定了基础。

创新点

['成功克隆并表达了来源于吸水链霉菌井冈变种的validamycin glycosyltransferase (ValG)', '首次直接使用游离静息细胞代替纯化酶进行生物转化，降低成本', '采用廉价的D-纤维二糖代替昂贵的UDP-葡萄糖作为糖供体', '通过响应面法优化培养基，使生物量和酶活较初始培养基提高近两倍']

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli BL21(DE3)	有效霉素生物合成途径	valG	有效霉素糖基转移酶 (ValG)	催化	重组表达菌株，全细胞催化有效氧胺A转化为有效霉素A
Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis	有效霉素生物合成途径	valG	有效霉素糖基转移酶 (ValG)	催化	valG基因的天然来源菌株

关键发现

克隆的valG基因长1269 bp，编码422个氨基酸，表达蛋白约47 kDa。以乳糖为碳源时酶活最高（0.76 U/mL），以酵母提取物为氮源时酶活最高（0.85 U/mL），复合氮源（酵母提取物37 g/L+氯化铵2 g/L）时酶活和生物量分别达1.08 U/mL和4.93 g/L。磷酸钾缓冲液100 mL/L时酶活1.29 U/mL，Ca2+
04 g/L时酶活1.45 U/mL、生物量5.48 g/L。经Box-Behnken优化后最佳培养基为乳糖4.7 g/L、酵母提取物49.5 g/L、氯化铵2.7 g/L、磷酸钾缓冲液110 mL/L、Ca2+
0352 g/L，预测最大酶活1.52 U/mL，验证实验实际酶活达1.49 U/mL，生物量达5.5 g/L，均为初始培养基的近两倍。

研究结论

成功在E. coli BL21(DE3)中表达ValG，并以游离静息细胞为催化剂、D-纤维二糖为糖供体实现有效氧胺A到有效霉素A的生物转化。通过响应面法优化培养基，使生物量和酶活达到5.5 g/L和1.49 U/mL，比初始培养基提高近两倍，为工业化应用奠定了基础。