Optimization of pullulanase production in Escherichia coli by regulation of process conditions and supplement with natural osmolytes
- 作者
- Xuguo Duan, Jian Chen, Jing Wu
- 单位
- State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University; School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education, Jiangnan University
- 杂志
- Bioresource Technology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2013.07.074
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组大肠杆菌表达普鲁兰酶时形成大量包涵体，导致可溶性酶产量低，限制其工业化生产。
研究策略
通过调控诱导温度、IPTG浓度、添加天然渗透调节物质（甜菜碱等）以及改进的两阶段甘油补料策略，减少包涵体形成并提高可溶性普鲁兰酶产量。
核心内容
针对重组大肠杆菌表达普鲁兰酶时包涵体形成严重、可溶性酶产量低的问题，本研究系统考察了诱导温度、IPTG浓度及天然渗透调节物质对可溶性表达的影响。结果表明，低温诱导（25℃）使总普鲁兰酶活性达36.5 U/mL，较37℃提高3.0倍；低浓度IPTG（0.05 mM）有利于胞外和周质酶活性，而高浓度IPTG显著抑制菌体生长。添加20 mM甜菜碱可使总可溶性普鲁兰酶提高1.3倍，且以初始时间为最佳添加时机。在3 L发酵罐中，结合25℃诱导与20 mM甜菜碱补加，并采用改进的两阶段甘油补料策略，总可溶性普鲁兰酶活性达到963.9 U/mL，产率为25.4 U/mL/h，较30℃不添加甜菜碱的条件提高8.3倍，最高比生产力达16.0×10³ U/g细胞。该策略通过温和的诱导条件与无毒廉价的甜菜碱协同作用，有效减轻了蛋白聚集倾向，实现了目前报道的最高普鲁兰酶产量，为重组酶工业制备提供了可行的过程调控方案。
创新点
['系统研究温度、IPTG浓度和多种渗透调节物质对可溶性普鲁兰酶表达的影响', '发现甜菜碱（20 mM）能显著促进普鲁兰酶可溶性表达', '提出改进的两阶段甘油补料策略并应用于3 L发酵罐，获得目前报道的最高普鲁兰酶产量']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 普鲁兰酶表达通路 | pulA | 普鲁兰酶（pullulanase） | 催化 | 来源于Bacillus deramificans，GenBank登录号CAC60157，分子量约101 kDa，由六个结构域组成，催化α-1,6糖苷键水解 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 重组蛋白表达调控 | — | — | 调控 | 通过降低诱导温度（25℃）、低IPTG浓度（0.05 mM）和添加甜菜碱调控可溶性表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 渗透压调节 | — | 甜菜碱（betaine） | 调控 | 作为化学分子伴侣/渗透保护剂，20 mM时促进蛋白质正确折叠，减少包涵体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甘油代谢 | — | — | 能量供给 | 两阶段甘油补料策略，以甘油为碳源和能量来源，预诱导阶段控制比生长速率0.20 h^-1，诱导后梯度递减补料 |
关键发现
- ['在摇瓶水平，25℃诱导时总普鲁兰酶活性达36.5 U/mL，比37℃高3.0倍', '当IPTG浓度为0.05 mM时，胞外和周质普鲁兰酶活性分别达13 U/mL和23 U/mL
- 4 mM IPTG时DCW仅为2.5 mg/mL，是对照的62.5%', '添加20 mM甜菜碱（无NaCl）使总可溶性普鲁兰酶提高1.3倍
- 20 mM甜菜碱时最大总活性为45.3 U/mL，80 mM时仅22.1 U/mL', '最佳甜菜碱添加时间为初始时间点，此时可溶性普鲁兰酶产量达49.4 U/mL', '3 L发酵罐中，25℃添加20 mM甜菜碱时，总可溶性普鲁兰酶活性达到963.9 U/mL，产率为25.4 U/mL/h，比不添加甜菜碱的30℃条件（115.8 U/mL）提高8.3倍', '周质可溶性普鲁兰酶活性在25℃+20 mM甜菜碱时达956.5 U/mL，平均产率25.4 U/mL/h', '最高比生产力达16.0×10^3 U/g细胞，是25℃无甜菜碱的3.4倍、30℃无甜菜碱的11.0倍、30℃有甜菜碱的2.0倍']
研究结论
通过降低诱导温度、使用低浓度IPTG并补充甜菜碱，结合改进的两阶段甘油补料策略，实现了大肠杆菌中可溶性普鲁兰酶的高水平生产，所得产量为目前报道的最高水平，且甜菜碱无毒廉价，具有工业应用潜力。