Disruption of lactate dehydrogenase and alcohol dehydrogenase for increased hydrogen production and its effect on metabolic flux in Enterobacter aerogenes

作者: Hongxin Zhao, Yuan Lu, Liyan Wang, Chong Zhang, Cheng Yang, Xinhui Xing
单位: Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, PR China; Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, PR China; College of Chemistry and Life Sciences, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, PR China
杂志: Bioresource Technology（2015）
DOI: 10.1016/j.biortech.2015.06.149
所属领域: 代谢工程
关键词: Alcohol dehydrogenaseConjugationEnterobacter aerogenesLactate dehydrogenaseMetabolic flux analysis
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解决的核心问题

在产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中，NADH主要通过乳酸和乙醇合成途径消耗，导致用于产氢的NADH不足，氢气产量受限。通过破坏乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶基因，减少NADH消耗，以提高氢气产量。

研究策略

采用自杀质粒pGP704介导的同源重组（接合转移）分别破坏ldhA和adh基因，构建单基因缺失突变株；通过血清瓶和5L发酵罐厌氧发酵评估产氢性能；利用代谢通量分析（MFA）揭示代谢通量重分布；测定关键酶活和代谢产物。

研究路线图

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核心内容

本研究以产气肠杆菌IAM1183为对象，通过自杀质粒pGP704介导的接合转移同源重组，分别敲除乳酸脱氢酶基因ldhA和乙醇脱氢酶基因adh，以减少NADH在副产物合成中的消耗，提高氢气产量。血清瓶发酵结果显示，ΔldhA突变株LDH酶活降至野生型的10%，总产气量达87.7 mL（野生型的2.19倍），氢气产量提高1.5倍，氢气摩尔分数升至88.7%，乳酸产量下降91.42%；而Δadh突变株虽乙醇产量下降30%，但ADH酶活仍保留37%，且FHL途径产氢完全受阻。代谢通量分析进一步表明ΔldhA的氢代谢通量显著增强。在5L发酵罐放大实验中，ΔldhA氢气总产量达5.6 L，为野生型（2.99 L）的2.3倍，细胞密度为野生型的1.7倍，终pH为5.96（野生型4.75），并观察到pH先降后升的动态变化。该研究证明敲除ldhA能有效重定向代谢通量、减少乳酸积累并显著提升产氢效率，为工业产氢菌株的代谢工程改造提供了重要参考。

创新点

1. 运用接合转移法在E. aerogenes中成功实现ldhA和adh基因的单交换敲除；2. 系统对比了LDH和ADH破坏对产氢及代谢通量的不同影响，发现ΔldhA显著提高产氢而Δadh反而抑制FHL途径；3. 在5L发酵罐中验证了ΔldhA的高产氢性能（2.3倍），并观察到pH先降后升的现象。

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Enterobacter aerogenes IAM1183	乳酸发酵途径	ldhA	乳酸脱氢酶 (Lactate dehydrogenase, LDH, EC 1.1.1.27)	催化	敲除后LDH活性降至10%，乳酸产量减少91.42%
Enterobacter aerogenes IAM1183	乙醇发酵途径	adh	乙醇脱氢酶 (Alcohol dehydrogenase, ADH, EC 1.1.1.1)	催化	敲除后ADH活性保留37%，乙醇产量减少30%

关键发现

敲除ldhA后，LDH酶活降至野生型的10%（指数期）和9%（稳定期）
血清瓶培养中，IAM1183-ΔldhA的总产气量为87.7±1.33 mL，为野生型的2.19倍，氢气产量提高1.5倍，氢气摩尔分数达88.7%（野生型58.3%），乳酸产量下降91.42%。敲除adh后，ADH酶活保留37%，乙醇产量下降30%。代谢通量分析显示ΔldhA的氢代谢通量增强，而Δadh的FHL途径产氢为零。在5L发酵罐中，IAM1183-ΔldhA的氢气总产量为5.6 L，是野生型（2.99 L）的2.3倍
细胞密度OD600为野生型的1.7倍
最终pH为5.96（野生型4.75），最低pH 5.39出现在15h，之后回升至5.96。乳酸产量降低94.58%。

研究结论

综上所述，通过破坏乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶基因可有效调控NADH代谢，增强产气肠杆菌的氢气产量。其中ΔldhA突变体在5L发酵罐中产氢量达到野生型的2.3倍，且乳酸大幅减少，是极具潜力的工业产氢菌株。该研究为阐明细菌产氢的生化机制提供了重要基础。