高级醇 · 代谢工程文献库

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Genetic Transformation of Artemisia carvifolia Buch with rol Genes Enhances Artemisinin Accumulation

作者
Erum Dilshad, Rosa Maria Cusido, Karla Ramirez Estrada, Mercedes Bonfill, Bushra Mirza
单位
Department of Biochemistry, Faculty of Biological Sciences, Quaid-i-Azam University, Islamabad, Pakistan; Laboratorio de Fisiologia Vegetal, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Spain
杂志
PLoS ONE（2015）
DOI
10.1371/journal.pone.0140266
所属领域
代谢工程
关键词
Agrobacterium tumefaciensArtemisia carvifoliaArtemisininrolBrolCtrichome density
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解决的核心问题

青蒿素价格高昂，其天然来源仅 Artemisia annua，且含量低（0.01-0.8%干重），急需提高产量或寻找替代来源。

研究策略

利用农杆菌介导将 rol B 和 rol C 基因转入 Artemisia carvifolia，比较野生型与转基因植株的青蒿素及其衍生物含量，并通过实时定量PCR分析青蒿素生物合成基因表达和毛状体密度。

研究路线图

100%
研究问题：青蒿素含量低、来源单一，急需替代途径
策略：农杆菌介导转入 rolB + rolC 基因至黄花蒿
关键改造：rolB/rolC 基因促进青蒿素合成基因表达
结果：青蒿素提高 3-7 倍，衍生物同步提升
结论：rol 基因可显著提升青蒿素积累，毛状体密度为关键指标
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核心内容

本研究利用农杆菌介导将发根农杆菌的 rol B 和 rol C 基因转入青蒿的近缘种 Artemisia carvifolia，以探索提升青蒿素产量的替代途径。结果显示，野生型 A. carvifolia 中青蒿素含量为 8 μg/g 干重，同时检测到青蒿酯、双氢青蒿素和蒿甲醚等衍生物。转基因植株的青蒿素积累显著增加：rol B 系提高 3 至 7 倍，rol C 系提高 2.3 至 6 倍，其中青蒿酯在 rol B 和 rol C 系中最高分别提升 10 倍和 8.9 倍。实时定量 PCR 分析表明，关键合成基因 CYP71AV1 表达在 rol B 和 rol C 系中分别上调 15 至 30 倍和 10 至 26 倍，ADS、ALDH1 和 TFAR1 表达亦同步增强。同时，转基因植株叶面毛状体密度从野生型的 5 至 7 个/cm² 增至 20 至 30 个/cm²，且与青蒿素含量呈正相关。上述结果表明，rol 基因通过激活青蒿素生物合成途径和促进毛状体发育，显著提升了 A. carvifolia 中青蒿素及其衍生物的积累，为开发新的青蒿素生产原料提供了可行策略。

创新点

首次在 Artemisia carvifolia 中检测到青蒿素及其衍生物，并证明 rol B 和 rol C 基因能显著提高其积累；发现毛状体密度与青蒿素积累正相关。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Artemisia carvifolia 青蒿素生物合成途径 ADS Amorpha-4,11-diene synthase 催化 催化法尼基二磷酸（FDP）环化形成 amorpha-4,11-diene，是青蒿素生物合成的第一步关键酶
Artemisia carvifolia 青蒿素生物合成途径 CYP71AV1 Cytochrome P450 monooxygenase 催化 氧化 amorpha-4,11-diene 生成 artemisinic alcohol
Artemisia carvifolia 青蒿素生物合成途径 ALDH1 Aldehyde dehydrogenase 1 催化 催化 artemisinic alcohol 转化为青蒿酸醛等中间体
Artemisia carvifolia 毛状体发育与倍半萜生物合成 TFAR1 Trichome-specific fatty acyl-CoA reductase 1 催化 参与毛状体发育及倍半萜生物合成，表达水平与毛状体密度相关
Artemisia carvifolia 植物激素信号通路 rolB RolB 调控 具有酪氨酸磷酸酶活性，调节生长素信号转导，增强次生代谢产物积累
Artemisia carvifolia 植物激素信号通路 rolC RolC 调控 具有细胞分裂素葡萄糖苷酶活性，刺激次生代谢产物产生

关键发现

  1. 野生型 A. carvifolia 中青蒿素含量为8μg/g，青蒿酯（artesunate）2.24μg/g，双氢青蒿素（DHA）13.6μg/g，蒿甲醚（artemether）12.8μg/g。rol B 转基因植株青蒿素含量提高3-7倍，rol C 转基因提高2.3-6倍。rol B 转基因中 artesunate 提高3-10倍，DHA 和 artemether 提高2.6-4倍
  2. rol C 转基因中 artesunate 提高4.4-8.9倍，DHA 提高2.3-3.2倍，artemether 提高2.3-5倍。CYP71AV1 基因表达在 rol B 和 rol C 转基因中分别提高15-30倍和10-26倍
  3. ALDH1 提高3-9倍和5-9倍
  4. ADS 提高2-6倍和3-6倍
  5. TFAR1 提高3-6倍和2-4倍。毛状体密度从野生型的5-7个/cm²增加到转基因的20-30个/cm²。

研究结论

将 rol B 和 rol C 基因转化 Artemisia carvifolia 可显著提高青蒿素及其衍生物积累，该效果与青蒿素生物合成基因的上调表达及毛状体密度增加相关。