Heterologous production of α-farnesene in metabolically engineered strains of Yarrowia lipolytica
- 作者
- Xia Yang, Komi Nambou, Liuqing Wei, Qiang Hua
- 单位
- State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, 130 Meilong Road, Shanghai 200237, PR China; Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing Technology, 130 Meilong Road, Shanghai 200237, China
- 杂志
- Bioresource Technology（2016）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2016.06.028
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在非常规产油酵母解脂耶氏酵母中异源合成α-法尼烯，解决合成酶表达量低和前体（IPP、DMAPP、FPP）供给不足的问题。
研究策略
通过密码子优化α-法尼烯合成酶基因、过表达甲羟戊酸途径关键基因（tHMG1、ERG20、IDI）、利用蛋白融合（OptFSLERG20）重定向FPP通量，并结合培养基优化和生物反应器放大。
研究路线图
核心内容
本研究在解脂耶氏酵母中实现了α-法尼烯的异源合成。通过密码子优化α-法尼烯合成酶基因（OptFS），获得初始产量2.75 mg/L；进一步过表达甲羟戊酸途径的截短HMG-CoA还原酶（tHMG1）将产量提升至6.12 mg/L。将优化后的合成酶与FPP合酶融合表达（OptFSLERG20），通过前体通道化使产量达到21.39 mg/L，较反向融合提高约30%。在此基础上同时过表达tHMG1、IPP异构酶（IDI）和融合基因，构建的P7菌株在摇瓶中产量达57.08 mg/L，为初始产量的20.8倍。在1.5 L生物反应器中结合PM培养基优化，最终α-法尼烯浓度达到259.98 mg/L，单位生物量产量为33.98 mg/g DCW，较初始水平提升94.5倍。该研究首次证明解脂耶氏酵母可通过密码子优化、蛋白融合、多基因过表达与发酵优化组合策略高效生产α-法尼烯，所获产量为当时工程酵母中的最高水平，为倍半萜类化合物的微生物合成提供了可行路径。
创新点
首次在解脂耶氏酵母中实现α-法尼烯的异源生产；采用密码子优化的合成酶；通过融合FPP合酶与α-法尼烯合酶提高前体通道化；组合多基因过表达和培养基优化实现了目前工程酵母中最高的α-法尼烯产量（33.98 mg/g DCW）。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica Polh | 甲羟戊酸途径 | FS | α-farnesene synthase (wild-type) | 催化 | 来自苹果果皮，未检测到产物，因此改为密码子优化的OptFS |
| Yarrowia lipolytica Polh | 甲羟戊酸途径 | OptFS | α-farnesene synthase (codon-optimized) | 催化 | 来自苹果(Malus x domestica)，密码子优化后实现在解脂耶氏酵母中的功能性表达 |
| Yarrowia lipolytica Polh | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | truncated HMG-CoA reductase | 催化 | 来自酿酒酵母，截短形式去除甾醇感受域，逃避反馈调节，增强MVA通量 |
| Yarrowia lipolytica Polh | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | farnesyl pyrophosphate synthase (FPP synthase) | 催化 | 来自解脂耶氏酵母，催化IPP和DMAPP缩合生成FPP |
| Yarrowia lipolytica Polh | 甲羟戊酸途径 | IDI | isopentenyl pyrophosphate isomerase (IPP isomerase) | 催化 | 来自解脂耶氏酵母，催化IPP与DMAPP异构化，平衡前体比例 |
| Yarrowia lipolytica Polh | 甲羟戊酸途径 | OptFSLERG20 | α-farnesene synthase-FPP synthase fusion protein | 催化 | 通过(GSG)连接子融合OptFS和ERG20，提高FPP向α-法尼烯的通道化 |
关键发现
- 通过密码子优化的α-法尼烯合成酶（OptFS）在解脂耶氏酵母中实现了α-法尼烯合成，P1菌株产量为2.75±0.29 mg/L
- 过表达tHMG1后P2菌株产量为6.12±0.32 mg/L
- 融合表达OptFSLERG20的P3菌株产量达21.39±0.61 mg/L，比反向融合P4（16.50±0.16 mg/L）高约30%
- 同时过表达tHMG1、IDI和融合基因的P7菌株在YPD摇瓶中产量达57.08±1.43 mg/L，为初始产量的20.8倍
- 在1.5 L生物反应器中采用PM培养基，P7菌株α-法尼烯浓度达259.98±2.15 mg/L，生物量7.65±1.40 g/L，α-法尼烯/生物量比33.98±1.51 mg/g，比初始产量提高94.5倍。
研究结论
本研究首次证明了解脂耶氏酵母能够通过代谢工程实现α-法尼烯的高产，通过密码子优化、蛋白融合、过表达MVA途径基因和培养基优化组合策略，最终获得的α-法尼烯产量（33.98 mg/g DCW）为已报道工程酵母中的最高水平，为倍半萜类化合物的微生物生产奠定基础。