Simultaneous fermentation of glucose and xylose at elevated temperatures co-produces ethanol and xylitol through overexpression of a xylose-specific transporter in engineered Kluyveromyces marxianus
- 作者
- Biao Zhang, Jia Zhang, Dongmei Wang, Ruixiang Han, Rui Ding, Xiaolian Gao, Lianhong Sun, Jiong Hong
- 单位
- School of Life Science, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui 230027, PR China; Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, Houston, TX 77004-5001, USA; Institutes of Life Sciences, Anhui Medical University, Hefei, Anhui 230032, PR China
- 杂志
- Bioresource Technology（2016）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2016.05.068
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素水解液中葡萄糖与木糖的同步利用问题，以及高温下高效共发酵生产乙醇和木糖醇。
研究策略
在耐热酵母 Kluyveromyces marxianus 中过表达木糖特异性转运蛋白 ScGAL2-N376F，结合破坏甘油合成基因 KmGPD1 等代谢工程改造，实现葡萄糖和木糖同步共发酵，葡萄糖产乙醇、木糖产高值木糖醇。
核心内容
研究以耐热酵母Kluyveromyces marxianus为底盘，通过过表达木糖特异性转运蛋白突变体ScGAL2-N376F，并结合多拷贝整合（约6拷贝）以及破坏甘油合成基因KmGPD1等代谢工程改造，构建了工程菌YZJ119，旨在实现高温下葡萄糖与木糖的同步共发酵，同时联产乙醇与木糖醇。在42°C下，该菌株能以120 g/L葡萄糖和60 g/L木糖为底物，同步产生50.10 g/L乙醇和55.88 g/L木糖醇，木糖醇得率高达0.99 g/g；在较低底物浓度下，28小时即产生40.43 g/L木糖醇和34.66 g/L乙醇，木糖醇生产强度达1.44 g/L/h。过表达木糖特异性转运蛋白使菌株在12小时的木糖醇产量达20.99 g/L，为对照菌株的两倍以上；破坏KmGPD1则将副产物甘油积累从6.12 g/L降至0.28 g/L。进一步以脱毒或非脱毒稀酸预处理玉米芯进行同步糖化共发酵，最高分别获得44.58 g/L乙醇和32.03 g/L木糖醇。该策略有效解除葡萄糖对木糖转运的竞争抑制并减少碳流损失，为木质纤维素高温生物炼制联产乙醇与木糖醇提供了高效菌株和可行工艺。
创新点
(1) 利用 ScGAL2-N376F 木糖特异性转运蛋白解除葡萄糖对木糖转运的竞争抑制；(2) 通过多拷贝整合提高转运蛋白表达水平至约6拷贝，显著提高共发酵能力；(3) 破坏 KmGPD1 阻断甘油合成减少碳流损失；(4) 在42°C高温下以不脱毒或脱毒稀酸预处理玉米芯实现同步糖化共发酵（SSCF）。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Kluyveromyces marxianus | 糖转运 | ScGAL2-N376F | Gal2-N376F (木糖特异性转运蛋白突变体) | 转运 | 来自酿酒酵母半乳糖通透酶 Gal2 的 N376F 突变体，对木糖特异且不受葡萄糖抑制，过表达可显著提高葡萄糖-木糖共发酵能力。 |
| Kluyveromyces marxianus | 甘油合成 | KmGPD1 | 甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 破坏该基因阻断甘油合成，使甘油积累由6.12 g/L降至0.28 g/L，同时减少乙酸积累。 |
| Kluyveromyces marxianus | 磷酸戊糖途径 | KmZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达以增强 NADPH 再生，但实际效果降低发酵性能。 |
| Kluyveromyces marxianus | 己糖转运 | KmHXT2 | 己糖转运蛋白 Hxt2 | 转运 | 破坏该葡萄糖偏好性转运蛋白未显著改善共发酵，可能因存在其他转运蛋白补偿。 |
| Kluyveromyces marxianus | 甘油/木糖醇转运 | KmFPS1 | 水甘油通道蛋白 Fps1 | 转运 | 过表达未显著提高木糖醇产量，可能因木糖醇产量限制。 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖转运 | CiGXF1 | 葡萄糖/木糖转运蛋白 Gxf1 | 转运 | 来自 Candida intermedia，具有木糖转运能力，但过表达未提高共发酵效率。 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖转运 | CiGXS1 | 葡萄糖/木糖转运蛋白 Gxs1 | 转运 | 来自 Candida intermedia，木糖-H+ 同向转运体，过表达未提高共发酵效率。 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖转运 | ScGAL2 | 半乳糖通透酶 Gal2 | 转运 | 来自酿酒酵母，具有木糖转运能力但受葡萄糖竞争抑制，过表达未提高木糖醇产量。 |
| Kluyveromyces marxianus | 木糖代谢 | NcXYL1 | 木糖还原酶 | 催化 | 来自粗糙脉孢菌，在组成型启动子下表达，不受葡萄糖抑制，将木糖还原为木糖醇。 |
| Kluyveromyces marxianus | 木糖代谢 | KmXYL2 | 木糖醇脱氢酶 | 催化 | 葡萄糖存在时其表达受抑制，导致木糖醇进一步代谢被阻断，有利于木糖醇积累。 |
关键发现
- 成功构建工程菌 YZJ119，在42°C下同时利用120 g/L葡萄糖和60 g/L木糖，产生50.10 g/L乙醇和55.88 g/L木糖醇，木糖醇得率超过98%（0.99 g/g）
- 在80 g/L葡萄糖+40 g/L木糖条件下，YZJ119 28 h产生40.43 g/L木糖醇和34.66 g/L乙醇，木糖醇生产强度1.44 g/L/h
- 过表达木糖特异性转运蛋白的菌株YZJ103在12 h产生20.99 g/L木糖醇，是其他菌株的2倍以上
- 破坏KmGPD1将甘油积累由6.12 g/L降至0.28 g/L，乙酸由2.12 g/L降至0.68 g/L
- 在SSCF中，利用脱毒及非脱毒稀酸预处理玉米芯，最高分别产生44.58 g/L乙醇和32.03 g/L木糖醇（脱毒）或29.82 g/L乙醇和31.72 g/L木糖醇（非脱毒）。
研究结论
研究表明，通过过表达木糖特异性转运蛋白和阻断副产物途径，可在高温下实现葡萄糖与木糖的同步共发酵，同时高效生产乙醇和木糖醇，为木质纤维素生物炼制提供了有前景的菌株和工艺。