Efficient production of 2,3-butanediol by recombinant Saccharomyces cerevisiae through modulation of gene expression by cocktail \(\delta\) -integration
- 作者
- Ryosuke Yamada, Kazuki Wakita, Ryosuke Mitsui, Riru Nishikawa, Hiroyasu Ogino
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Osaka Prefecture University, 1-1 Gakuen-cho, Naka-ku, Sakai, Osaka 599-8531, Japan
- 杂志
- Bioresource Technology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2017.05.034
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过代谢工程在非致病的酿酒酵母中高效生产2,3-丁二醇，并解决因NADH过量引起的氧化还原失衡问题，以获得高于现有致病菌和非致病菌的产率及产量。
研究策略
采用cocktail δ-integration策略，将来自枯草芽孢杆菌的α-乙酰乳酸合酶（BsAlsS）、解淀粉芽孢杆菌的α-乙酰乳酸脱羧酶（BaAlsD）和2,3-丁二醇脱氢酶（BaBdhA）以及乳酸乳球菌的NADH氧化酶（LINoxE）多拷贝整合到酿酒酵母基因组中，同时敲除ADH1、PDC1和GPD1基因以减少副产物，通过高通量筛选获得高产菌株，并优化补料分批发酵条件。
核心内容
本研究在酿酒酵母YPH499中采用cocktail δ-integration策略，将枯草芽孢杆菌的α-乙酰乳酸合酶、解淀粉芽孢杆菌的α-乙酰乳酸脱羧酶和2,3-丁二醇脱氢酶以及乳酸乳球菌的NADH氧化酶多拷贝整合至基因组，同时敲除ADH1、PDC1和GPD1以减少副产物生成。通过高通量筛选获得高产菌株，并经补料分批发酵优化，最终菌株YPH499/dPdAdG/BD6-10的2,3-丁二醇浓度达到80.0 g/L，生产速率达4.00 g/L/h，产率为41.7%，其中碳产率在阶段1-2达55.6%。该生产速率为所有已报道微生物中的最高值，产率为酿酒酵母中的迄今最高纪录。共表达NADH氧化酶有效缓解了生产过程中的氧化还原失衡，与无该酶的对照菌株相比，生产速率从0.18 g/L/h提升至0.28 g/L/h。转录分析显示关键基因表达水平得到不同程度增强。该工作证明cocktail δ-integration策略无需精确解析限速步骤即可有效协调多基因表达，为代谢工程中复杂途径的优化提供了通用且高效的解决方案。
创新点
1. 首次将cocktail δ-integration策略应用于2,3-丁二醇生产，无需精确了解限速步骤即可同时调节多基因表达；2. 通过共表达NADH氧化酶有效缓解了2,3-丁二醇生产过程中的氧化还原失衡问题；3. 获得的2,3-丁二醇生产速率（4.00 g/L/h）和产率（41.7%）为酿酒酵母中迄今最高，且生产速率在所有报道的微生物中最高。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母YPH499 | 2,3-丁二醇生物合成途径 | BsAlsS | α-乙酰乳酸合酶 | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌，催化丙酮酸生成α-乙酰乳酸 |
| 酿酒酵母YPH499 | 2,3-丁二醇生物合成途径 | BaAlsD | α-乙酰乳酸脱羧酶 | 催化 | 来自解淀粉芽孢杆菌，催化α-乙酰乳酸生成乙偶姻 |
| 酿酒酵母YPH499 | 2,3-丁二醇生物合成途径 | BaBdhA | 2,3-丁二醇脱氢酶 | 催化 | 来自解淀粉芽孢杆菌，催化乙偶姻生成2,3-丁二醇 |
| 酿酒酵母YPH499 | 辅因子再生/氧化还原平衡 | LINoxE | NADH氧化酶 | 催化 | 来自乳酸乳球菌，催化NADH氧化为NAD+，缓解氧化还原失衡 |
| 酿酒酵母YPH499 | 乙醇合成途径 | ADH1 | 醇脱氢酶I | 催化 | 敲除，减少乙醇副产物 |
| 酿酒酵母YPH499 | 丙酮酸代谢 | PDC1 | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 敲除，减少乙醇副产物 |
| 酿酒酵母YPH499 | 甘油合成途径 | GPD1 | 甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 敲除，减少甘油副产物 |
关键发现
- 在补料分批发酵中，菌株YPH499/dPdAdG/BD6-10的2,3-丁二醇浓度达到80.0 g/L，生产速率4.00 g/L/h，产率41.7%（阶段1-2碳产率为55.6%），为迄今酿酒酵母中最高，且生产速率在所有微生物中最高。摇瓶培养中，YPH499/dPdAdG/BD6-10在25 h内产生7.08 g/L 2,3-丁二醇，产率0.28 g/L/h，碳产率35.5%
- 对照菌株YPH499/dPdAdG/BD6-6（无LINoxE）在40 h内产生7.27 g/L，产率0.18 g/L/h，碳产率37.1%。通过δ-integration筛选，90个转化子中68%产生可检测2,3-丁二醇，42%产量高于表位菌株
- 548个转化子中20.1%产生可检测乙偶姻。转录水平分析显示，BsAlsS和BaAlsD转录水平分别提高1.27倍和1.56倍，BaBdhA无显著变化。
研究结论
通过cocktail δ-integration策略成功构建了高效生产2,3-丁二醇的酿酒酵母菌株YPH499/dPdAdG/BD6-10，在补料分批发酵中获得目前报道的最高生产速率和产率，表明该策略在代谢工程中具有广阔的应用前景。