Transporter engineering for cellobiose fermentation under lower pH conditions by engineered Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Eun Joong Oh, Suryang Kwak, Heejin Kim, Yong-Su Jin
- 单位
- Department of Food Science and Human Nutrition, Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Bioresource Technology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2017.05.138
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在低pH条件下，酿酒酵母无法有效发酵纤维二糖，因为来自粗糙脉孢菌的细胞糊精转运蛋白CDT-2在酸性条件下转运活性低，且低pH会抑制细胞生长和发酵。
研究策略
通过定向进化结合流式细胞荧光分选（FACS）和连续传代培养，筛选能够在低pH条件下高效转运纤维二糖的CDT-2突变体；以GFP融合监测蛋白表达与稳定性。
核心内容
针对酿酒酵母在低pH条件下纤维二糖转运效率低的问题，该研究通过定向进化结合流式细胞荧光分选和连续传代培养，筛选出来源于粗糙脉孢菌的细胞糊精转运蛋白CDT-2突变体I96N/T487A，并以GFP融合监测蛋白表达稳定性。在含2 g/L乙酸、pH 3.3的培养基中，表达突变体的菌株纤维二糖消耗速率比表达野生型CDT-1和CDT-2分别高51%和55%，达0.069 g/g cell/h；在含80 g/L纤维二糖的YP培养基中，突变体30小时消耗速率较野生型CDT-2高30%，乙醇产率提高31%至0.38 g/g。初始pH 3时，突变体特异性消耗速率为0.155 g/g cell/h，而野生型为0.082 g/g cell/h，且pH 3与pH 6下活性比率达0.963，远高于野生型的0.863；荧光强度约为野生型3倍，证明蛋白稳定性或表达量显著提升。该结果表明，通过转运蛋白工程改良底物亲和力与蛋白稳定性，可有效增强酵母在低pH及乙酸胁迫下的纤维二糖发酵性能，为提升木质纤维素水解液发酵效率提供了可推广的改造策略。
创新点
获得CDT-2双突变体（I96N/T487A），该突变体改善了低pH条件下的纤维二糖转运活性和蛋白稳定性；证明转运蛋白工程可以增强酵母对低pH和乙酸等抑制物的耐受性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖利用与乙醇发酵 | cdt-2 (突变体 I96N/T487A) | 细胞糊精转运蛋白2（CDT-2）突变体 | 转运 | 通过定向进化获得的突变体，在低pH下具有更高的转运活性和稳定性 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖利用与乙醇发酵 | gh1-1 | β-葡萄糖苷酶（GH1-1） | 催化 | 来自粗糙脉孢菌的胞内β-葡萄糖苷酶，将纤维二糖水解为葡萄糖 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖利用与乙醇发酵 | cdt-1 | 细胞糊精转运蛋白1（CDT-1） | 转运 | 野生型质子共转运体，与CDT-2突变体进行比较，在乙酸条件下表现不如后者 |
关键发现
- 通过定向进化、FACS筛选和连续传代获得CDT-2突变体I96N/T487A
- 该突变体在含2 g/L乙酸的最小培养基中（pH 3.3）比野生型CDT-1和CDT-2的纤维二糖消耗速率分别高51%和55%，达到0.069 g/g cell/h
- 在YP培养基（含80 g/L纤维二糖）中，DBT2M菌株（突变体）在30小时的纤维二糖消耗速率为2.35 g/L·h，比野生型CDT-2的1.79 g/L·h高30%，乙醇产率为0.38 g/g，比0.29 g/g高31%
- 在SC培养基（pH 6，40 g/L纤维二糖）中培养76小时，DBT2M消耗25 g/L纤维二糖并产生6.9 g/L乙醇，而DBT2W仅消耗14 g/L并产生2.5 g/L乙醇
- 初始pH 3时，DBT2M的特异性纤维二糖消耗速率为0.155 g/g cell/h，而DBT2W为0.082 g/g cell/h，pH 3与pH 6的比率分别为0.963和0.863
- 在pH 3条件下，突变CDT-2的GFP荧光强度约为野生型的3倍，表明其稳定性或表达量提高。
研究结论
获得的CDT-2突变体（I96N/T487A）在低pH和乙酸存在条件下显著改善了酿酒酵母的纤维二糖发酵性能，这得益于其增强的转运活性和蛋白稳定性；该转运蛋白工程策略可进一步应用于提高酵母对木质纤维素水解液中其他抑制物（如HMF和糠醛）的耐受性。