Directed Evolution and Resolution Mechanism of 1, 3-Propanediol Oxidoreductase from Klebsiella pneumoniae toward Higher Activity by Error-Prone PCR and Bioinformatics
- 作者
- Wei Jiang, Yuan Zhuang, Shizhen Wang, Baishan Fang
- 单位
- Department of Chemical and Biochemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen, Fujian, 361005, China; The Key Lab for Synthetic Biotechnology of Xiamen City, Xiamen University, Xiamen, Fujian, 361005, China; The Key Laboratory for Industrial Biotechnology of Fujian Higher Education, Hua Qiao University, Xiamen, Fujian, China; The Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, Xiamen University, Xiamen, Fujian, 361005, China
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0141837
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
提高肺炎克雷伯菌1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）的活性，以促进甘油生物转化为1,3-丙二醇的效率。
研究策略
采用易错PCR构建dhaT基因随机突变文库，结合番红O平板高通量筛选提高活性的突变体，并通过分子对接模拟分析突变体与底物和辅酶的相互作用机制。
核心内容
本研究针对肺炎克雷伯菌中1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）活性不足、限制甘油生物转化为1,3-丙二醇效率的问题，采用易错PCR构建dhaT基因随机突变文库，并结合番红O平板高通量筛选方法，成功获得多个活性提升的突变体。经四轮定向进化与筛选，最优突变体PDOR'-24（单点突变A199S）的酶活达到48 U/mg，是野生型（9.9 U/mg）的4.9倍，且比此前报道的优化菌株活性高出9.7倍；突变体库筛选后总活性从2.9 U/mL提升至182 U/mL。其他突变体PDOR'-39（D94H）、PDOR'-73（V1551）和PDOR'-85（D94H及C端缺失3个氨基酸）的活性分别为2.3、8.1和0.81 U/mg。分子对接模拟揭示A199S突变通过改变底物3-HPA与辅酶NADH的结合微环境增强催化效率，并预测了关键结合残基。该研究首次实现对PDOR的定向进化，建立的番红O平板筛选方法适用于氧化还原酶类，为1,3-丙二醇生物合成及同类酶的改造提供了有效策略与潜在改造位点。
创新点
首次通过定向进化提高PDOR活性；建立了基于番红O平板的高通量筛选方法，适用于氧化还原酶；通过分子对接揭示了A199S突变提高活性的潜在结构机制。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae DSM2026 | 甘油歧化生成1,3-丙二醇途径 | dhaT | PDOR (野生型) | 催化 | 目的基因来源菌株 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甘油歧化生成1,3-丙二醇途径 | dhaT (突变体) | PDOR'-24 (A199S) | 催化 | 高活性突变体，活性为野生型的4.9倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甘油歧化生成1,3-丙二醇途径 | dhaT (突变体) | PDOR'-39 (D94H) | 催化 | 活性显著降低的突变体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甘油歧化生成1,3-丙二醇途径 | dhaT (突变体) | PDOR'-73 (V1551) | 催化 | 活性降低的突变体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甘油歧化生成1,3-丙二醇途径 | dhaT (突变体) | PDOR'-85 (D94H, C端缺失3个氨基酸) | 催化 | 活性最低的突变体 |
关键发现
- 通过四轮易错PCR和一轮筛选，获得突变体PDOR'-24（单点突变A199S），其酶活性为48 U/mg，是野生型（9.9 U/mg）的4.9倍，且比之前报道的菌株经优化后的活性高9.7倍
- 突变体库筛选后活性从2.9 U/mL提高到182 U/mL。其他突变体PDOR'-39（D94H）、PDOR'-73（V1551）、PDOR'-85（D94H且C端缺失3个氨基酸）的活性分别为2.3、8.1、0.81 U/mg。分子对接预测与NADH结合的氨基酸为S103、H271、N366、D106、N262和D364，与3-HPA结合的为Asp198。
研究结论
本研究成功运用定向进化与番红O平板筛选提高了肺炎克雷伯菌PDOR的活性，最优突变体活性提高4.9倍，并通过分子对接分析了突变影响酶活性的结构机制，为氧化还原酶的定向进化提供了有效方法和潜在改造位点。