Engineering thermotolerant Kluyveromyces marxianus strains for resveratrol production by simultaneous saccharification and fermentation of whole slurry corn cob
- 作者
- Marlene Baptista, Carlos E. Costa, Lucília Domingues
- 单位
- Centre of Biological Engineering, University of Minho, Campus Gualtar, 4710-057 Braga, Portugal; LABBELS – Associate Laboratory, Braga/Guimarães, Portugal
- 杂志
- Bioresource Technology（2024）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2024.131755
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用耐热马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）以木质纤维素原料（玉米芯）为可持续底物，高效生物合成高价值抗氧化剂白藜芦醇，并实现全浆同步糖化发酵（SSF）的一体化工艺，以减少对植物提取和化学合成的依赖。
研究策略
通过将黄杆菌来源的酪氨酸解氨酶基因FJTA1、拟南芥来源的p-香豆酰-CoA连接酶基因At4CL2和葡萄来源的白藜芦醇合酶基因VvVST1组成的酪氨酸途径引入两株K. marxianus（S9和YBL001），利用葡萄糖、木糖和/或乙醇作为碳源进行白藜芦醇从头合成；并利用菌株的耐热特性，在37°C下对自水解预处理的玉米芯半纤维素水解液及全浆进行SSF。
核心内容
本研究将黄杆菌酪氨酸解氨酶（FJTA1）、拟南芥p-香豆酰-CoA连接酶（At4CL2）和葡萄白藜芦醇合酶（VvVST1）组成的合成途径导入耐热马克斯克鲁维酵母S9和YBL001，实现白藜芦醇从头合成。研究发现木糖比葡萄糖更有利于白藜芦醇合成，单位糖产量比葡萄糖条件高1.8–2.1倍，且乙醇补料通过减少木糖醇积累和增加乙酰-CoA供给，使两菌株产量提高约1.8–1.9倍。在37°C下对自水解预处理玉米芯全浆进行同步糖化发酵，S9-RBP和YBL001-RBP产量分别达69.26±5.57和68.61±9.19 mg/L，较水解液发酵提高约6.0和9.3倍。此外，170 g/L高浓度葡萄糖会转向乙醇发酵并大幅增加甘油积累，48小时后白藜芦醇因pH升至8而降解。该研究首次实现马克斯克鲁维酵母利用木质纤维素全浆生产白藜芦醇，为可持续生物合成高值化合物提供了新路径。
创新点
首次报道K. marxianus生产白藜芦醇；首次使用玉米芯全浆通过SSF生产白藜芦醇；发现木糖比葡萄糖更有利于白藜芦醇合成，乙醇补料通过减少木糖醇积累和增加乙酰-CoA供给提高产量；利用耐热菌株在37°C下进行SSF，接近纤维素酶最适温度，提高糖化效率。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Kluyveromyces marxianus S9, YBL001 | 酪氨酸衍生的p-香豆酸合成途径 | FJTA1 (FjTAL) | 酪氨酸解氨酶 (tyrosine ammonia lyase, 来自Flavobacterium johnsoniae) | 催化 | 催化酪氨酸脱氨生成p-香豆酸，是白藜芦醇前体合成第一步 |
| Kluyveromyces marxianus S9, YBL001 | 白藜芦醇生物合成途径 | At4CL2 | p-香豆酰-CoA连接酶 (4-coumarate-CoA ligase, 来自Arabidopsis thaliana) | 催化 | 催化p-香豆酸转化为p-香豆酰-CoA，反应需ATP并经过p-香豆酸-AMP中间体 |
| Kluyveromyces marxianus S9, YBL001 | 白藜芦醇生物合成途径 | VvVST1 | 白藜芦醇合酶 (resveratrol synthase, 来自Vitis vinifera) | 催化 | 缩合3分子丙二酰-CoA与1分子p-香豆酰-CoA生成白藜芦醇；为途径限速酶，使用强启动子表达 |
| Kluyveromyces marxianus S9, YBL001 | 莽草酸途径/芳香族氨基酸生物合成 | ARO3, ARO7, ARO4 | Aro3p、Aro7p、Aro4p (DAHP合酶、分支酸变位酶等) | 调控 | 受酪氨酸积累反馈抑制，限制莽草酸途径通量，导致p-香豆酸积累 |
| Kluyveromyces marxianus S9, YBL001 | 丙二酰-CoA合成 | ACC1 | 乙酰-CoA羧化酶 (acetyl-CoA carboxylase) | 催化 | 催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA；被认为是p-香豆酰-CoA转化白藜芦醇的下游瓶颈 |
| Kluyveromyces marxianus S9, YBL001 | 木糖代谢（戊糖磷酸途径） | — | 木糖还原酶 (xylose reductase) 和木糖醇脱氢酶 (xylitol dehydrogenase) | 催化 | 木糖经XR/XDH途径代谢，辅因子不平衡导致木糖醇积累；乙醇补料可减少木糖醇生成 |
| Kluyveromyces marxianus S9, YBL001 | 中心碳代谢/乙醇代谢 | — | 乙醇代谢相关酶（内源，如乙醇脱氢酶/乙醛脱氢酶） | 能量供给 | 乙醇作为辅助底物可转化为乙酰-CoA，为白藜芦醇合成提供丙二酰-CoA前体 |
| — | 纤维素糖化 | — | 纤维素酶混合物 Cellic CTec2 (Novozymes) | 催化 | 用于全浆同步糖化发酵，添加量12 FPU/g，酶活122 FPU/mL |
关键发现
- 300 rpm条件下，S9-FjTAL和YBL001-FjTAL的p-香豆酸产量比200 rpm分别提高2.6倍和1.5倍；YBL001-FjTAL在YPD中最高达31.12±0.02 mg/L。② 葡萄糖发酵中，S9-RBP和YBL001-RBP在36、105、170 g/L葡萄糖下白藜芦醇产量分别为9.16、15.06、21.21 mg/L和8.25、16.52、24.98 mg/L；产量与生物量线性相关（R²=0.998）。③ 以木糖为碳源时，S9-RBP和YBL001-RBP在96 h产量为12.57±1.53和10.88±0.72 mg/L，单位糖产量比葡萄糖条件高1.8倍（0.44 mg/g）和2.1倍（0.48 mg/g）。④ 乙醇补料使两菌株白藜芦醇产量分别提高到22.05±2.30和20.60±0.50 mg/L（约1.8倍和1.9倍），同时p-香豆酸积累降低2.1倍和2.7倍，木糖醇积累降至<1 g/L；未补乙醇时S9和YBL001木糖醇分别达3.12±0.02和1.21±0.03 g/L。⑤ 玉米芯水解液发酵中，S9-RBP产量为11.58±0.41 mg/L，比YBL001-RBP（7.38±0.68 mg/L）高1.6倍。⑥ 全浆SSF（37°C，5%固含，12 FPU/g纤维素酶）中，S9-RBP和YBL001-RBP产量高达69.26±5.57和68.61±9.19 mg/L，分别比水解液提高约6.0倍和9.3倍，最高生产率为1.44±0.12和1.43±0.19 mg/L/h。⑦ 全浆中p-香豆酸在72 h时积累至S9
- 52±1.76 mg/L、YBL001
- 79±0.62 mg/L。⑧ 玉米芯水解液含木糖21.13±0.01 g/L、葡萄糖1.70±0.23 g/L、阿拉伯糖3.57±0.02 g/L、乙酸3.05±0.12 g/L，全浆中p-香豆酸22.96±0.12 mg/L。⑨ 170 g/L葡萄糖条件下仅产生乙醇，S9-RBP甘油产量较36 g/L时提高98倍，YBL001提高36倍。⑩ 48 h后白藜芦醇因pH升至8而降解，需在48 h收获。
研究结论
本研究首次证明K. marxianus能够利用葡萄糖、木糖和/或乙醇从头合成p-香豆酸和白藜芦醇；木糖通过戊糖磷酸途径有利于乙酰-CoA供应，乙醇补料通过减少木糖醇积累提高白藜芦醇产量。通过全浆SSF在37°C下实现玉米芯全组分利用，最高产量69.26 mg/L，为木质纤维素原料生产白藜芦醇及循环生物经济奠定基础。进一步优化方向包括提高p-香豆酸转化、解除莽草酸途径反馈抑制和整合多拷贝白藜芦醇合成途径。