高级醇 · 代谢工程文献库

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Production of xylitol by expressing xylitol dehydrogenase and alcohol dehydrogenase from Gluconobacter thailandicus and co-biotransformation of whole cells

作者
Huanhuan Zhang, Junhua Yun, H. Zabed, Miaomiao Yang, Guoyan Zhang, Yilin Qi, Qi Guo, Xianghui Qi
单位
School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University; College of Science and Technology, Hebei Agricultural University
杂志
Bioresource Technology（2018）
DOI
10.1016/j.biortech.2018.02.095
所属领域
代谢工程
关键词
Alcohol dehydrogenaseCo-biotransformationGluconobacter thailandicusXylitolXylitol dehydrogenase
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解决的核心问题

D-阿拉伯醇生物转化生产木糖醇过程中，XDH需要NADH作为辅因子，但重组菌株无法有效再生NADH，需添加外源NADH，导致成本高、效率低。

研究策略

从Gluconobacter thailandicus中克隆木糖醇脱氢酶基因xdh和醇脱氢酶基因adh，分别在E. coli BL21(DE3)中表达，构建重组菌BL21-xdh和BL21-adh；将原始菌G. thailandicus与两种重组菌按优化比例混合培养，利用ADH以乙醇为底物再生NADH，实现辅因子自给的全细胞共生物转化D-阿拉伯醇生产木糖醇。

研究路线图

100%
研究问题：D-阿拉伯醇转化木糖醇需外源NADH，成本高效率低
策略：克隆xdh与adh基因，构建重组E. coli菌株
关键改造：三菌共培养，ADH再生NADH
关键发现：XDH特性与动力学参数解析
结果：木糖醇产量34.34 g/L，产率提升2.7倍
结论：辅因子自给共转化体系，绿色生物制造新策略
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核心内容

本研究从泰国葡萄糖杆菌中克隆了新型木糖醇脱氢酶基因xdh和醇脱氢酶基因adh，分别于大肠杆菌BL21(DE3)中表达，构建重组菌BL21-xdh与BL21-adh。通过将原始菌G. thailandicus与两种重组菌按质量比30:20:20混合共培养，以乙醇为底物由ADH再生NADH，实现了无需外源辅因子的全细胞生物转化体系。酶学表征显示XDH对D-木酮糖的Km为20.7 mM，Vmax为132.8 U/mg，最适pH和温度分别为9.0和35°C。在优化条件下，三菌共培养48小时从40 g/L D-阿拉伯醇产34.34 g/L木糖醇，最大产率0.86 g/g，较野生菌单独培养提高2.7倍，且较双菌混合培养提高4.8%。该产率优于已报道的多种重组系统，证明辅因子自给策略有效解决了NADH再生瓶颈，为木糖醇绿色生物制造提供了经济可行的新方案。

创新点

['克隆并表达了来自G. thailandicus的新型xdh和adh基因', '构建无需外源NADH的辅因子自给共生物转化系统', '三菌共培养使木糖醇产量较野生菌提高2.7倍']

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
E. coli BL21(DE3) 木糖醇合成途径 xdh 木糖醇脱氢酶 (XDH) 催化 催化D-木酮糖还原为木糖醇，需NADH
E. coli BL21(DE3) 辅因子再生途径 adh 醇脱氢酶 (ADH) 能量供给 催化乙醇氧化为乙醛，再生NADH
G. thailandicus CGMCC1.3748 D-阿拉伯醇代谢途径 — D-阿拉伯醇脱氢酶 (ArDH) 催化 催化D-阿拉伯醇氧化为D-木酮糖

关键发现

  1. ['克隆的xdh和adh基因长度分别为0.8 kb和0.4 kb，编码266和134个氨基酸
  2. SDS-PAGE显示XDH和ADH蛋白分子量分别约为33 kDa和19 kDa。', '纯化XDH的最适pH：氧化D-木酮糖为9.0，还原木糖醇为6.0
  3. 最适温度分别为35°C和30°C。', 'XDH特异性活性：对木糖醇为16.6 U/mg，对D-木酮糖为50.2 U/mg，对D-甘露醇14.4 U/mg，D-山梨醇10.7 U/mg，乙醇4.2 U/mg，D-果糖30.1 U/mg。', 'XDH动力学参数：对D-木酮糖Km=20.7 mM，Vmax=132.8 U/mg
  4. 对木糖醇Km=63.3 mM，Vmax=98.6 U/mg
  5. 对NADH Km=4.2 mM，Vmax=55.6 U/mg
  6. 对NAD+ Km=14.1 mM，Vmax=39.0 U/mg。', '优化条件下（40 g/L D-阿拉伯醇，菌体质量比G. thailandicus:BL21-xdh:BL21-adh=30:20:20），三菌共培养48 h产34.34 g/L木糖醇，最大产率0.86 g/g（36 h），是野生菌单独培养（30 h产12.55 g/L，产率0.31 g/g）的2.7倍，比G. thailandicus与BL21-xdh混合培养的产率（0.82 g/g）提高4.8%。', '本研究产率（0.86 g/g）优于文献报道的E. coli Rosetta/Duet-xdh-adh系统（24.9 g/L，85.2%）和G. oxydans-xdh-gdh系统（12.23 g/L，40.8%）以及G. oxydans PZ重组菌（29.3 g/L，73.2%）。']

研究结论

本研究成功克隆并表达了G. thailandicus的新型xdh和adh基因，通过将原始菌与两种重组菌混合培养，构建了辅因子自主再生的全细胞共生物转化体系，在无需外源NADH的条件下高效将D-阿拉伯醇转化为木糖醇，产量和产率具有竞争力，为木糖醇的绿色生物制造提供了新策略。