Enhancing oleanolic acid production in engineered Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Yujia Zhao, Jingjing Fan, Chen Wang, Xudong Feng, Chun Li
- 单位
- Institute for Synthetic Biosystem, Department of Biochemical Engineering, School of Chemistry and Chemical Engineering, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China; Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China
- 杂志
- Bioresource Technology（2018）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2018.02.096
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母中齐墩果酸生物合成产量低，难以满足工业化生产需求。
研究策略
通过优化CYP450与CPR的氧化还原配对效率，重构半乳糖调控网络（敲除GAL1和GAL80），并过表达MVA途径及前体供给关键基因（tHMGR1、ERG9、ERG1）来提高齐墩果酸产量。
研究路线图
核心内容
针对酿酒酵母中齐墩果酸产量低的问题，该研究系统整合了氧化还原系统优化、调控网络重构与前体供给强化策略。首先通过筛选，鉴定出与CYP716A12高效配对的MtCPR，使产量由初始的2.5 mg/L提升至9.0 mg/L。随后敲除GAL1和GAL80，解除了半乳糖调控网络对异源基因的依赖，使菌株在葡萄糖条件下高效转录，产量逐步提升至41.3和70.3 mg/L。在此基础上过表达MVA途径与前体合成关键基因tHMGR1、ERG9和ERG1，摇瓶产量达到186.1 mg/L。最终在5 L发酵罐中优化葡萄糖浓度至40 g/L，齐墩果酸产量达到606.9 mg/L，产率为16.0 mg/g DCW，较此前报道的最高水平提高7.6倍。该研究通过多层次的代谢工程改造，实现了酿酒酵母中齐墩果酸的最高产量记录，为三萜类化合物的微生物工业化生产提供了有效策略。
创新点
1. 系统筛选并鉴定出与CYP716A12高效配对的MtCPR，显著提高氧化还原效率；2. 通过敲除GAL1和GAL80，使异源基因在葡萄糖条件下也能高效转录，降低生产成本；3. 整合过表达多个前体基因，实现齐墩果酸在微生物中的最高产量。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 齐墩果酸生物合成 | GgbAS | β-香树脂醇合酶 (β-amyrin synthase) | 催化 | 来自甘草 (Glycyrrhiza glabra)，催化2,3-氧化鲨烯生成β-香树脂醇 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 齐墩果酸生物合成 | MtCYP716A12 | 齐墩果酸合酶 (细胞色素P450单加氧酶) | 催化 | 来自蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)，催化β-香树脂醇C-28位氧化生成齐墩果酸 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 氧化还原系统 | MtCPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自蒺藜苜蓿，与CYP716A12配对效率最高，显著提升齐墩果酸产量 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 氧化还原系统 | AtCPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自拟南芥，与CYP716A12配对效率最低 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 氧化还原系统 | LjCPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自百脉根，配对效率介于AtCPR和MtCPR之间 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 氧化还原系统 | GuCPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自甘草，配对效率低于MtCPR但高于LjCPR |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 半乳糖代谢 | GAL1 | 半乳糖激酶 | 调控 | 敲除该基因以阻止半乳糖被代谢消耗，使半乳糖作为GAL启动子的诱导剂，提高异源基因表达 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 半乳糖代谢调控 | GAL80 | 转录抑制因子Gal80 | 调控 | 敲除该基因后，解除对Gal4的抑制，使GAL启动子在葡萄糖条件下也能高效表达异源基因 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 (MVA) | tHMGR1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以增强MVA途径通量，增加前体IPP和DMAPP供应 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甾醇/三萜前体合成 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 过表达以促进两分子法尼基焦磷酸缩合生成鲨烯 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甾醇/三萜前体合成 | ERG1 | 鲨烯环氧酶 | 催化 | 过表达以催化鲨烯环氧化生成2,3-氧化鲨烯，为齐墩果酸提供直接前体 |
关键发现
- 初始菌株OA01齐墩果酸产量仅2.5±0.2 mg/L
- 引入MtCPR后（OA02）产量提高到9.0±0.7 mg/L，为OA01的2.6倍
- 敲除GAL1后（OA05）产量达41.3±3.4 mg/L，为OA02的3.6倍
- 进一步敲除GAL80（OA06）产量达70.3±7.0 mg/L，较OA05提高0.7倍
- 再过表达tHMGR1、ERG9和ERG1（OA07），摇瓶产量达186.1±12.4 mg/L，较OA06提高1.6倍
- 在5 L发酵罐中优化葡萄糖浓度（40 g/L）后，最终齐墩果酸产量达606.9±9.1 mg/L，产率16.0±0.8 mg/g DCW，较报道最高产量提高7.6倍。
研究结论
通过优化氧化还原系统、重构半乳糖调控网络和增强前体供给，可大幅提升酿酒酵母中齐墩果酸的产量，本研究获得的606.9 mg/L为目前微生物合成齐墩果酸的最高水平，为工业化生产奠定了基础。