Extra metabolic burden by displaying over secreting: growth, fermentation and enzymatic activity in cellobiose of recombinant yeast expressing β-glucosidase
- 作者
- Juanjuan Ding, Guohong Liang, Kun Zhang, Jiefang Hong, Shaolan Zou, Haiyan Lu, Yuanyuan Ma, Minhua Zhang
- 单位
- Tianjin R&D Center for Petrochemical Technology, Tianjin University; Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University; School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University; Key Laboratory for Green Chemical Technology of Ministry of Education, Tianjin University; State Key Laboratory of Engine, Tianjin University
- 杂志
- Bioresource Technology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.biortech.2017.12.030
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析β-葡萄糖苷酶在酵母中表达时，细胞表面展示与分泌两种运输策略对细胞造成的代谢负担差异及其影响因素（基因来源、基因剂量、氧供应）
研究策略
构建14株表达β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株，分别采用细胞表面展示或分泌方式，在纤维二糖和葡萄糖培养基中，于好氧/厌氧条件下系统比较其生长、发酵性能及酶活
研究路线图
核心内容
本研究构建了14株分别以细胞表面展示或分泌方式表达β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株，系统比较了两种蛋白运输策略对细胞代谢负担的影响。结果显示，与分泌型菌株相比，表面展示型菌株普遍表现出更长的延滞期、更低的比生长速率、更低的总体酶活及乙醇滴度，证明展示策略会带来额外的代谢负担，且该负担随基因拷贝数增加而加重，与质粒或染色体整合方式无关。其中来自黑曲霉的BGL1性能优于纤维二糖酵母来源，携带纤维二糖酵母BGL1多拷贝质粒的菌株在纤维二糖中几乎无法生长，好氧OD660仅1.31。无锚定菌株的胞外酶活占总酶活的42.2%~50.1%，而锚定菌株仅1.0%~6.7%。在玉米秸秆同步糖化发酵中，最佳展示型和分泌型菌株乙醇滴度分别达2.133和2.394 g/100g，为理论产率的64.2%和72.0%。该研究明确了表面展示策略的代谢代价及其影响因素，为纤维素乙醇生产中β-葡萄糖苷酶表达策略的理性选择提供了依据。
创新点
首次在相同条件下直接比较了来自黑曲霉（Aspergillus aculeatus）和纤维二糖酵母（Saccharomycopsis fibuligera）的BGL1基因以展示或分泌方式表达时的代谢负担；证明了展示比分泌带来额外代谢负担，且该负担随基因拷贝数增加而加重，与质粒或染色体整合方式无关
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | 纤维二糖利用与乙醇发酵 | BGL1 (SfBGL1) | β-葡萄糖苷酶I (Bgl1) | 催化 | 来自Saccharomycopsis fibuligera，水解纤维二糖为葡萄糖 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | 纤维二糖利用与乙醇发酵 | BGL1 (AaBGL1) | β-葡萄糖苷酶I (Bgl1) | 催化 | 来自Aspergillus aculeatus，性能优于SfBGL1 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | 细胞壁锚定 | CWP2 | Cwp2p | 区室化 | GPI锚定蛋白，用于β-葡萄糖苷酶的细胞表面展示 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | 基因表达调控 | Ppti-xyn2s启动子 | — | 调控 | 组成型启动子，驱动BGL1基因表达 |
关键发现
- 构建了14株表达β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母。与分泌型相比，细胞表面展示型菌株整体表现出更长的延滞期、更低的μ_m、更低的总酶活和乙醇滴度，好氧下生物量更低、厌氧下生物量更高。基因拷贝数增加会加剧代谢负担，多拷贝YEplac195载体菌株比单拷贝YCplac33或单拷贝整合菌株影响更显著。来自A. aculeatus的BGL1性能优于S. fibuligera的BGL1，其中菌株YE-Sf-C在纤维二糖中基本无法生长和发酵（好氧OD660仅1.31，厌氧1.42）。好氧条件下最大OD660为12.75~16.24，厌氧为7.41~10.26
- 厌氧下到达稳定期时间比好氧缩短12~36 h。无锚定菌株的胞外酶活占总酶活的42.2%~50.1%，而有Cwp2锚定的菌株仅占1.0%~6.7%。在玉米秸秆同步糖化发酵（SSF）中，菌株YE-Aa-C和YE-Aa的最大乙醇滴度分别为2.133和2.394 g/100g，分别为理论产率的64.2%和72.0%。
研究结论
细胞表面展示β-葡萄糖苷酶比分泌方式造成额外的代谢负担，该负担随基因拷贝数增加而增大，且与表达方式（质粒或染色体整合）无关；A. aculeatus BGL1基因赋予宿主更好的纤维二糖利用和乙醇发酵性能；在实际应用中需权衡展示与分泌策略的利弊。