高级醇 · 代谢工程文献库

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Cultivation of Pichia pastoris carrying the scFv anti LDL (-) antibody fragment. Effect of preculture carbon source

作者
Cesar Andres Diaz Arias, Daniela de Araujo Viana Marques, Luciana Pellegrini Malpiedi, Andrea Queiroz Maranhão, Dulcineia Abdalla Saes Parra, Attilio Converti, Adalberto Pessoa Junior
单位
Universidade de São Paulo, Departamento Bioquímico - Tecnologia Farmacêutica, São Paulo, SP, Brazil; Universidade Rural Federal de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Recife, PE, Brazil; Universidade Nacional de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Laboratório de Imunologia Molecular, Brasília, DF, Brazil; Universidade de São Paulo, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológica, São Paulo, SP, Brazil; University of Genoa, Department of Civil, Chemical and Environmental Engineering, Italy
杂志
Brazilian Journal of Microbiology（2017）
DOI
10.1016/j.bjm.2016.11.009
所属领域
发酵工程
关键词
Carbon sourceCryopreservationExpressionPichia pastorisscFv antibody fragment
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解决的核心问题

重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达 scFv anti LDL(-) 抗体片段时，预培养碳源（葡萄糖或甘油）对冷冻保存后细胞活力、培养动力学和重组蛋白产量的影响不明确，缺乏标准化的预适应和保存方案，制约了过程效率和工业放大。

研究策略

比较以葡萄糖或甘油为碳源预培养后、于20%（v/v）甘油中-80°C冷冻保存的重组毕赤酵母细胞，分别在摇瓶和3-L生物反应器中用甘油培养基进行培养，并以甲醇诱导表达scFv抗体片段；通过测定细胞存活率、生长动力学、甘油消耗、抗体产量和生产率等来评估碳源影响。

研究路线图

100%
研究问题：预培养碳源（葡萄糖vs甘油）对重组毕赤酵母表达scFv的影响
策略：甘油/葡萄糖预培养后-80°C冻存，摇瓶与3-L反应器培养，甲醇诱导表达scFv
关键改造①：甘油预培养缩短延迟期约8小时（vs葡萄糖）
关键改造②：冻存存活率提升（存活损失6.3% vs 7.8%）
结果（摇瓶）：体积生产率0.20 vs 0.14 mg/L/h（+42.9%）
结果（反应器）：抗体浓度60.2 vs 55.8 mg/L，生产率0.83 vs 0.77 mg/L/h
结论：全程使用甘油可获更高产量/生产率，缩短总时间约8h（>8%）
关键改造③：反应器生产率是摇瓶的4.2~5.5倍
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核心内容

本研究以重组毕赤酵母SMD 1168表达scFv anti LDL(-)抗体片段为对象，系统比较了预培养碳源（葡萄糖或甘油）对冷冻保存后细胞活力、培养动力学及重组蛋白产量的影响。研究者将两种碳源预培养的细胞于20%甘油中-80°C冻存，随后在摇瓶和3-L生物反应器中以甘油培养基培养并用甲醇诱导表达。结果显示，甘油预培养在摇瓶中使scFv体积生产率达到0.20 mg/L/h，较葡萄糖预培养（0.14 mg/L/h）提高42.9%，最终抗体浓度分别为14.4 mg/L和10.1 mg/L；在生物反应器中，甘油预培养使甘油在24小时内几乎耗尽（残余0.5 g/L），而葡萄糖预培养需32小时，最终抗体浓度为60.2 mg/L，较葡萄糖预培养（55.8 mg/L）高约8%。此外，甘油预培养将延迟期缩短约8小时，冻存后活菌损失也更低。生物反应器生产率约为摇瓶的4-5倍。该研究确立了预培养、冻存及培养全程使用甘油的标准化流程，可显著提升细胞生长、产物产量及过程效率，为同类重组蛋白生产提供了可借鉴的操作策略。

创新点

首次针对scFv anti LDL(-)抗体片段生产系统评估了预培养碳源的影响；证明甘油预培养优于葡萄糖，可缩短延迟期约8小时；提出了预培养、冷冻保存和培养全程使用甘油的标准化流程，显著提高体积生产率。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Pichia pastoris SMD 1168 (Δpep4::URA3, ΔkeX::SUC2, his4 ura3, His-, Mut+) 甲醇调控的异源蛋白表达 AOX1 (启动子) — 调控 AOX1启动子在甲醇存在时诱导表达，葡萄糖/乙醇存在时被抑制，用于驱动scFv anti LDL(-) 抗体片段表达。
Pichia pastoris SMD 1168 (Δpep4::URA3, ΔkeX::SUC2, his4 ura3, His-, Mut+) 甲醇代谢 AOX1 醇氧化酶1 催化 AOX1编码醇氧化酶，催化甲醇氧化为甲醛；本研究中主要利用其启动子，该酶催化功能为背景信息。
Pichia pastoris SMD 1168 (Δpep4::URA3, ΔkeX::SUC2, his4 ura3, His-, Mut+) 蛋白降解 pep4 蛋白酶A 催化 pep4基因缺失以减少蛋白酶对重组scFv的降解，提高产物稳定性。

关键发现

  1. 摇瓶中，甘油预培养的 scFv 体积生产率为
  2. 20±0.05 mg/L/h，比葡萄糖预培养（0.14±0.03 mg/L/h）高
  3. 9%；最终抗体浓度分别为
  4. 4±0.01 mg/L 和
  5. 1±0.01 mg/L。在生物反应器中，甘油预培养使细胞在 24h 内几乎耗尽甘油（残余
  6. 5 g/L），而葡萄糖预培养需 32h；甘油预培养最终抗体浓度为
  7. 2±0.01 mg/L，比葡萄糖预培养（55.8±0.01 mg/L）高约 8%，生产率
  8. 83±0.04 mg/L/h vs
  9. 77±0.02 mg/L/h。生物反应器中的生产率是摇瓶的
  10. 2 倍（甘油预培养）和
  11. 5 倍（葡萄糖预培养）。冻存前后活菌损失：葡萄糖预培养为
  12. 8% 和
  13. 1%，甘油预培养为
  14. 3% 和
  15. 8%。甘油预培养使过程总时间缩短约 8 小时（超过总生产时间的 8%）。scFv 由 260 个氨基酸组成，理论分子量
  16. 64 kDa，pI
  17. 9；SDS-PAGE 显示约 28 kDa 条带。

研究结论

本研究表明，对于重组 P. pastoris SMD 1168 生产 scFv anti LDL(-) 抗体片段，在预培养、冷冻保存和培养阶段均使用甘油作为碳源可获得更高细胞生长、更快甘油消耗、更高的抗体片段产量和生产率，并缩短约 8 小时的过程时间；生物反应器比摇瓶更适合该生产过程。